嗜热真菌Chaetomium thermophilum新型烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶的生化与结构表征及其在NAD+ 生物合成中的应用

　　本研究针对NAD+ 工业化生产过程中传统提取法效率低、化学合成法条件苛刻等问题，首次解析了嗜热真菌Chaetomium thermophilum来源的烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶（CtNMNAT）的2.10?晶体结构（PDB:9IW1）。该酶在60°C和pH6.0条件下展现优异的热稳定性（50°C半衰期25.9小时）与催化效率（kcat /KM =180 s?1 ·mM?1 ），并实现72.0 g·L?1 ·d?1 的NAD+ 时空产率，为高温环境下的辅酶生物制造提供了新策略。

　　

NAD⁺
作为氧化还原代谢和信号转导的核心辅因子，其工业化生产长期面临两大瓶颈：酵母提取法纯度低（仅数克/千克细胞），化学合成法依赖高纯度β-NMN和精确锰离子调控。尽管George M. Whitesides团队早于1984年开发了多酶级联催化体系，但现有NMNAT（烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶）普遍存在热稳定性不足的问题——极端微生物来源的酶需高温激活，而常温酶在工业苛刻条件下易失活。这一矛盾促使华东理工大学等机构的研究人员将目光投向嗜热真菌这一尚未开发的资源宝库。

研究团队选择嗜热真菌Chaetomium thermophilum为研究对象，通过基因优化表达获得重组CtNMNAT。X射线衍射解析显示该酶晶体属P2₁
2₁
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空间群，二聚体结构中清晰可见NMN结合口袋。酶学分析揭示其最适条件为pH6.0和60°C，在50°C下半衰期长达25.9小时，远超已报道的多数同源酶。值得注意的是，其k_cat
/K_M
值达180 s^?1
·mM^?1
，催化制备NAD⁺
的浓度提升至28.5 mM，时空产率突破72.0 g·L^?1
·d^?1
，这些指标均指向其工业化应用潜力。

关键技术方面，研究采用大肠杆菌异源表达系统，通过分子置换法（以人源NMNAT1为模板）解析晶体结构。酶活测定采用紫外分光光度法监测340 nm处NADH生成，热稳定性通过残余活性评估，产物分析采用HPLC定量。

蛋白表达与晶体结构
重组CtNMNAT经pET28a载体在E. coli BL21(DE3)中表达，晶体衍射显示每个不对称单元含两个单体。活性口袋中NMN分子的精确定位为阐明催化机制提供了结构基础。

酶学特性
区别于常温酶，CtNMNAT在50-60°C区间保持稳定，其k_cat
/K_M
值较部分细菌来源酶提高近8倍，且能耐受工业反应体系中常见的离子干扰。

生物催化应用
在优化体系中，NAD⁺
产率较传统酵母提取法提升两个数量级，且产物易分离纯化，避免了复杂细胞裂解液的杂质干扰。

该研究首次将真菌来源NMNAT的热稳定性与高催化效率相结合，其结构特征为理性设计耐热酶提供了模板。从应用角度看，CtNMNAT不仅简化了NAD⁺
生产工艺，更可能推动高温催化、辅酶再生等领域的技术革新。正如作者Jian-He Xu团队强调的，这项工作为理解嗜热真菌NAD⁺
代谢开辟了新视角，其工业转化价值值得期待。论文发表于《Biochemical and Biophysical Research Communications》，相关结构数据已公开（PDB:9IW1）。