假蜜环菌醛酮还原酶AtAKR297克隆表达及对AFB1转化作用

　　 摘要: 【背景】黄曲霉毒素B1 (aflatoxin B1, AFB1)是迄今为止发现的毒性最强的生物毒素之一，它通过污染花生、玉米、棉花和辣椒等不同作物，对人类和动物健康造成严重威胁

　　 摘要:

【背景】黄曲霉毒素B₁ (aflatoxin B₁, AFB₁)是迄今为止发现的毒性最强的生物毒素之一，它通过污染花生、玉米、棉花和辣椒等不同作物，对人类和动物健康造成严重威胁。由于醛酮还原酶能够将多种醛酮类物质还原为毒性更小的醇类物质从而发挥解毒作用，所以推测醛酮还原酶可能具有转化AFB₁的可能。【目的】克隆了假蜜环菌(Armillariella tabescens)中的醛酮还原酶AtAKR297，以研究醛酮还原酶AtAKR297对AFB₁的转化作用。【方法】使用TRIzol法提取假蜜环菌的总RNA，根据蛋白质谱获取的肽段信息及cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技术获取醛酮还原酶AtAKR297基因全长序列；构建醛酮还原酶AtAKR297的表达系统，用亲和层析对蛋白进行纯化，并进行酶活力检测及酶学性质分析。在pH 8.0缓冲体系中，将醛酮还原酶AtAKR297与AFB₁反应12 h，用高效液相色谱仪对残余的AFB₁进行检测，并用高分辨率液相色谱-质谱仪对转化产物进行鉴定。【结果】成功克隆出假蜜环菌的全长AtAKR297基因，基因长度为894 bp，共编码297个氨基酸；pET28a(+)-AtAKR297质粒转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)宿主菌中，实现诱导表达并对酶学性质进行分析。AtAKR297的最适反应温度为20 ℃，最适反应pH值为8.0；在15-50 ℃具有较好的稳定性，孵育30 min酶活可维持60%以上；在pH 5.0-8.0具有较好的稳定性，孵育2 h酶活可维持75%以上。醛酮还原酶AtAKR297与AFB₁的相互作用质谱鉴定结果显示AtAKR297能作用于AFB₁ (依赖NADPH)，将AFB₁还原为毒性降低的黄曲霉毒醇(aflatoxicol, AFL)，该产物分子式为C₁₇H₁₄O₆。【结论】成功从假蜜环菌中克隆出醛酮还原酶基因AtAKR297，并构建了具有醛酮还原酶活性的AtAKR297的原核表达系统。AtAKR297在NADPH的存在下能将AFB₁还原为毒性降低的AFL。