摘要: 奥沙利铂(oxaliplatin, Oxa) 是进展期结直肠癌化疗常用药物, 然而多数患者在接受治疗后出现耐药, 相关耐药机制尚未完全阐明。本研究以结直肠癌细胞HCT116为对象, 通过药物浓度梯度诱导构建奥沙利铂耐药细胞株(HCT116/Oxa)。在此基础上基于蛋白质组学分析HCT116/Oxa细胞表达谱; 采用The Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) 数据库进行基因本体(gene ontolog, GO) 分析; 利用GeneAnalytics数据库通路富集分析; 通过抑制剂、免疫印迹、siRNA技术揭示结直肠癌细胞对奥沙利铂耐药的潜在靶标及其机制。结果显示, HCT116/Oxa细胞对奥沙利铂的耐药指数为10.2。与HCT116相比, HCT116/Oxa对奥沙利铂表现出强的增殖潜能和抗凋亡能力。蛋白质组数据表明, HCT116/Oxa细胞717种基因表达改变, 上调399种, 下调318种。GO分析显示, 差异表达基因与氧化压力反应、铁代谢、脂质代谢、凋亡、细胞周期进展等生物学过程有关。通路富集显示, 细胞代谢、铁死亡、Nrf2-ARE信号、脂肪酸及谷胱甘肽代谢等通路显著变化。定量结果显示, 与铁死亡相关分子, 包括谷胱甘肽过氧化物酶4 (glutathione peroxidase 4, GPX4)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基(glutamate-cysteine ligase regulatory subunit, GCLM)、铁蛋白轻链(ferritin light chain, FTL)、铁蛋白重链(ferritin heavy chain, FTH1)、血红素氧合酶1 (heme oxygenase 1, HMOX1)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GSR) 和NADH脱氢酶1 (NADH dehydrogenase 1, NQO1) 的表达显著增加, 而长链脂肪酸-辅酶A连接酶(long chain fatty acid-CoA ligase, ACSL) 4和ACSL1的表达降低。功能研究表明, GPX4特异性抑制剂RSL3降低耐药细胞活力, 提高脂质过氧化水平, 增加亚铁离子和丙二醛含量, 降低谷胱甘肽(glutathione, GSH) 浓度。免疫印迹显示, HCT116/Oxa细胞中GPX4、FTH1、FTL、GSR表达增加, ACSL4降低。RSL3能够逆转GPX4、FTH1、FTL、GSR和ACSL4的水平。进一步发现, 敲低GPX4可降低耐药细胞活力, 提高脂质过氧化水平和降低GSH浓度, 表明GSH/GPX4通路介导的铁死亡抵抗是HCT116/Oxa对奥沙利铂耐药的潜在机制, 抑制GSH/GPX4通路是逆转结直肠癌对奥沙利铂耐药的途径。
