定向进化偶联菌体生长策略提高L-天冬酰胺酶催化活性的研究

　　 摘要: L-天冬酰胺酶(L-asparaginase, ASNase) 是一种氨基水解酶, 被广泛应用在医药和食品领域

　　

摘要: L-天冬酰胺酶(L-asparaginase, ASNase) 是一种氨基水解酶, 被广泛应用在医药和食品领域。其中, 来源于Escherichia coli K12的EcASNase已被用作治疗急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL) 的临床药物。但EcASNase较低的催化活性和稳定性限制了其在医药和食品等领域的应用。本研究通过易错PCR构建随机突变文库, 结合偶联菌体生长的高通量筛选策略, 筛选获得了三个活性提高的阳性突变体G38S、Q212Y、S274P, 其活性分别是野生型(WT) 的1.4、1.1和1.2倍。随后对38、212、274位点构建了饱和突变文库并进行了筛选, 获得了活性提高的突变体G38A、G38S、G38Q、G38V, 其k_cat/K_m值分别是WT的1.7、1.5、2.1和2.2倍, 活性最优突变体G38V的T_m值较WT提高8.4 ℃, 对上述突变体进行组合突变, 突变体G38V/Q212F、G38V/S274P的活性未能进一步提高。本研究不仅阐明了关键位点对酶活性和稳定性的贡献, 还为治疗性酶的设计与开发提供了新思路。