具备高效CRISPR协同激活活性的HIEC6-dCas9-SAM稳转细胞株构建

　　 摘要： 目的 以人正常肠道上皮细胞（HIEC6）为研究模型，建立具有高水平转录激活活性的HIEC6-dCas9-SAM单克隆细胞株，为利用CRISPR激活（CRISPR activation, CRISPRa）系统筛选人类肠道疾病发生发展相关关键基因和探究分子致病机制提供细胞工具

　　

摘要：

目的 以人正常肠道上皮细胞（HIEC6）为研究模型，建立具有高水平转录激活活性的HIEC6-dCas9-SAM单克隆细胞株，为利用CRISPR激活（CRISPR activation, CRISPRa）系统筛选人类肠道疾病发生发展相关关键基因和探究分子致病机制提供细胞工具。 方法 首先利用PiggyBac转座子系统构建HIEC6-dCas9-SAM多克隆细胞；然后通过有限稀释法筛选单克隆细胞株，并使用免疫印迹、间接免疫荧光法鉴定单克隆细胞株中dCas9-SAM蛋白（dCas9、VP64、MS2、HSF1、p65）的表达情况；最后利用CRISPRa荧光报告系统和构建包装特定靶基因sgRNA慢病毒，检测所构建稳转株在转录和蛋白水平的CRISPR激活效率。 结果 成功获得两株HIEC6-dCas9-SAM单克隆细胞，两株细胞均能高水平稳定表达dCas9-SAM蛋白。CRISPRa荧光报告系统检测显示，两株HIEC6-dCas9-SAM稳转细胞的激活效率分别高达96.7%、99.0%。靶基因激活功能验证显示，在转录水平，两株HIEC6-dCas9-SAM稳转细胞中靶基因APN的转录激活水平分别高达2 725倍和4 521倍，SLC35A1基因的转录激活水平分别为27.5倍和18.1倍；在蛋白水平，APN蛋白的激活效率分别高于12.9倍和11.2倍，SLC35A1蛋白的激活效率分别为1.32倍和0.97倍。两株单克隆稳转细胞均表现出较高的转录激活活性。 结论 成功构建两株具有高水平CRISPR转录激活活性的HIEC6-dCas9-SAM单克隆稳转细胞，为后续基于CRISPRa系统筛选人类肠道疾病发生发展相关关键基因和探究分子致病机制提供了重要细胞工具。