基因工程改造的人iPSC来源NK细胞通过CCL19/CCR2B/CD16/NKG2D复合体增强抗实体瘤活性

　　本研究针对实体瘤免疫治疗中NK细胞浸润不足、免疫抑制微环境等挑战，通过基因工程改造人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的NK细胞，使其共表达CCL19、CCR2B、高亲和力CD16、IL-15及NKG2D-DAP10复合体。研究证实改造后的eNK细胞显著提升肿瘤浸润能力、树突细胞募集效率及体内持久性，在肺癌小鼠模型中展现出卓越的抗肿瘤效果，为实体瘤"现货型"细胞疗法提供新策略。

　　

实体瘤免疫治疗的破局者：基因武装的"超级NK细胞"

当前，CAR-T和CAR-NK细胞疗法在血液肿瘤中取得突破，但实体瘤治疗仍面临三大"路障"：免疫细胞难以浸润致密的肿瘤组织、免疫抑制性微环境的压制，以及肿瘤抗原逃逸现象。更棘手的是，传统NK细胞存在供体依赖性、异质性等问题。如何打造能突破这些屏障的"通用型"免疫细胞武器，成为癌症治疗领域的重要命题。

日本HEALIOS K.K.研究所的Yuma Fukutani团队在《Stem Cell Research》发表创新成果，通过多基因协同改造策略，将人诱导多能干细胞（hiPSC）打造成对抗实体瘤的"细胞武器库"。研究人员采用piggyBac转座子系统一次性整合CCL19、CCR2B、FCGR3A（CD16）、IL15、KLRK1（NKG2D）和HCST（DAP10）六个基因，通过三维生物反应器分化体系获得基因工程NK细胞（18H5-eNK）。关键技术包括：多基因转座子整合、流式细胞术筛选、肿瘤球体共培养模型、正交移植小鼠模型，以及基于Alu序列的体内追踪技术。

基因工程hiPSC-NK细胞的构建与验证

研究团队设计的"六基因套装"各司其职：CCL19负责募集树突细胞，CCR2B增强肿瘤归巢，高亲和力CD16（176F/V变体）提升抗体依赖性细胞毒性（ADCC），IL-15维持细胞存活，NKG2D-DAP10复合体强化肿瘤识别。通过RAISING技术确认13个拷贝的转基因单等位基因整合，RNA-seq显示转基因高效表达且不影响内源基因。分化获得的18H5-eNK细胞CD56⁺纯度超80%，保留穿孔素（PERFORIN）和颗粒酶B（GRANZYME B）表达，且不表达CD3，符合典型NK细胞特征。

多功能协同的抗肿瘤机制

在杀伤功能方面，18H5-eNK细胞对A549肺癌细胞的溶解率较普通iNK细胞提升2倍，且能广谱杀伤7种实体瘤细胞系。机制研究发现：

• NKG2D-DAP10复合体通过识别肿瘤表面MICA/MICB分子激活杀伤信号，使用阻断抗体后IFN-γ分泌量下降60%

• 高亲和力CD16与西妥昔单抗联用使肿瘤球体荧光强度在48小时内降低75%，展现卓越的ADCC效应

• CCR2B过表达使eNK细胞在肿瘤球体中的浸润面积增加1.5倍，该效应可被CCR2抑制剂RS504393完全逆转

• CCL19分泌诱导树突细胞定向迁移，96小时时eNK组迁移DC数量达iNK组的8倍

突破免疫检查点的独特优势

在模拟肿瘤微环境的实验中，IFN-γ处理的A549细胞高表达HLA-E（提升3倍），但18H5-eNK细胞因缺乏NKG2A表达（仅3%阳性，原代NK为72%），不受此免疫检查点抑制。值得注意的是，这些细胞对IFN-γ处理的正常PBMC仍保持"零误伤"，显示精准的肿瘤特异性。

体内疗效的持久革命

在正交移植肺癌模型中，18H5-eNK细胞表现出三大突破：

1. 持久性：单次注射后可在NOG小鼠血液中检测至77天

2. 浸润性：肿瘤部位eNK细胞数量是iNK组的2.3倍

3. 治愈潜力：三次注射后41天内完全抑制H1975-luc肿瘤生长，且无体重下降等毒性

这项研究开创性地通过多基因协同改造策略，解决了实体瘤免疫治疗的多个关键瓶颈。18H5-eNK细胞不仅具备"自我导航"（CCR2B）、"呼叫援军"（CCL19）、"持久作战"（IL-15）等创新特性，更通过基因编辑规避了HLA-E免疫检查点。这种模块化设计思路为开发下一代"现货型"细胞疗法提供了技术蓝图，其三维生物反应器生产工艺更具备临床转化潜力。未来，该平台可与PD-1/PD-L1抑制剂联用，进一步突破免疫抑制微环境，或成为对抗实体瘤的"终极细胞武器"。