钙信号-MYC-SOX5/SOX6轴调控软骨细胞早期去分化及促进软骨再生的机制研究

　　本研究针对软骨组织工程中软骨细胞体外扩增时表型丢失（去分化）这一关键瓶颈问题，通过单细胞测序和染色质可及性测序技术，系统揭示了钙离子内流通过下调MYC表达导致SOX5/SOX6减少的分子机制。研究发现抑制钙信号可逆转早期去分化表型，显著提升P3代软骨细胞的再生能力，为优化软骨再生体系提供了新策略（ACI）。该成果发表于《Stem Cell Research》，对先天性小耳畸形和骨关节炎等软骨缺损修复具有重要临床意义。

　　

软骨缺损修复一直是临床面临的重大挑战，从先天性小耳畸形到骨关节炎，软骨组织的再生能力有限使得治疗困难重重。虽然自体软骨细胞移植（ACI）和组织工程技术展现出前景，但体外扩增过程中软骨细胞会逐渐失去特异性表型——这种现象被称为"去分化"。更令人困扰的是，早期去分化的P3代细胞尚能恢复软骨形成能力，而晚期P6代细胞却不可逆地转向肥大化，这种差异背后的机制始终成谜。

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院的研究团队在《Stem Cell Research》发表的重要研究中，首次绘制了人耳软骨细胞去分化过程的高分辨率单细胞图谱。通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、染色质可及性测序（ATAC-seq）和功能实验，研究人员不仅揭示了钙信号-MYC-SOX5/SOX6这一全新调控轴，还发现抑制钙离子内流可有效逆转早期去分化，显著提升软骨再生效果。这项研究为优化软骨组织工程提供了关键理论依据和治疗靶点。

研究采用三大关键技术：首先对3例患者P1、P3、P6代耳软骨细胞进行10xgenomics单细胞测序，构建包含89,200个细胞的转录组图谱；其次通过ATAC-seq分析染色质开放状态变化；最后运用全细胞膜片钳、钙离子荧光探针和cut&tag等技术验证机制。临床样本来自该院接受鼓室成形术患者的残余耳软骨。

细胞谱系与分化轨迹方面，研究鉴定出5种细胞亚群：基质细胞（SC，标志物SOX5/SOX6/SNED1）、分化软骨细胞（CDC，SOX9/MGP）、前肥大细胞（PHC，COL1A1/MMP2）、增殖细胞（PROC）和软骨祖细胞（CPC）。随着传代，SC和CDC比例从P1到P6逐渐减少，而PHC和CPC显著增加。轨迹分析显示CPC可向CDC或PHC分化，后者表现出肥大化特征。

细胞传代表型变化方面，P3代表现出最强的增殖能力（EdU阳性率最高）和有氧代谢水平（OCR曲线峰值），而P6代则转向无氧代谢并高表达肥大化标志物。ATAC-seq显示P3代染色质开放区域急剧增加，涉及钙信号通路基因（如CALM2）和细胞周期调控元件，而P6代开放区域则与钙通路和骨化相关。

钙信号调控机制方面，膜片钳证实P3代钙电流显著增强。使用L型钙通道阻滞剂尼非地平处理后，RNA-seq显示373个基因上调，包括SOX5/SOX6等软骨相关转录因子。功能实验表明尼非地平可降低P3代增殖率，恢复线粒体膜电位，并显著提升体外和体内（裸鼠皮下植入）软骨再生质量。

分子机制解析方面，蛋白质互作网络确定MYC为核心调控因子。cut&tag显示P3代c-MYC在SOX5/SOX6基因区域的结合减少。机制上，钙离子上调钙调蛋白（CALM2），后者竞争性结合RNA稳定蛋白HuR，导致MYC mRNA降解。shRNA敲低MYC可逆转尼非地平对SOX5/SOX6的上调作用，证实该通路的关键地位。

这项研究首次系统阐明了软骨细胞去分化过程的细胞和分子特征：早期（P3）表现为染色质开放、增殖增强和有氧代谢活跃的去分化状态；晚期（P6）则转向肥大化谱系。发现的钙-MYC-SOX5/SOX6轴不仅解释了为何早期去分化可逆而晚期不可逆，更提供了通过抑制钙信号（如尼非地平）优化软骨再生的新策略。该成果对先天性小耳畸形耳廓再造和骨关节炎的ACI治疗具有重要转化价值，未来可进一步探索钙信号抑制剂与组织工程支架的结合应用。研究建立的单细胞图谱也为其他类型软骨细胞研究提供了宝贵资源。