基于不对称重组酶聚合扩增与多组分DNAzyme辅助靶标循环生物传感器（OAR-MNA）的超灵敏检疫病原体现场检测技术

　　这篇研究开发了一种创新的OAR-MNA生物传感器，通过不对称RPA（aRPA）与多组分DNAzyme（MNAzyme）联用，实现了对瓜类细菌性果斑病病原体（Acidovorax citrulli）的现场检测。该系统灵敏度达20拷贝/μL，成本较荧光RPA降低50%，且与便携式DNA分析仪兼容，为植物检疫提供了高特异性、低成本的解决方案。

　　

1 引言

检疫病原体如瓜类细菌性果斑病（BFB）病原体Acidovorax citrulli对全球农业构成严重威胁。现有检测技术如PCR和ELISA依赖复杂设备，而等温扩增技术（如RPA）虽快速但存在假阳性风险。多组分DNAzyme（MNAzyme）因其低成本和高催化效率成为理想检测工具，但其依赖单链DNA（ssDNA）的特性与RPA产生双链DNA（dsDNA）的矛盾亟待解决。

2 材料与方法

研究团队开发了OAR-MNA生物传感器，通过优化不对称RPA（aRPA）引物比例（10,000 nM正向引物:31.25 nM反向引物）高效生成ssDNA。MNAzyme系统包含分裂催化域的partzymes和含RNA切割位点的荧光淬灭（FQ）探针。便携式DNA分析仪集成480 nm激光模块，可实现"+/?"结果输出。

3 结果与讨论

3.1 技术原理

aRPA通过限制反向引物产生过量ssDNA，激活MNAzyme切割FQ探针释放荧光信号（图1）。该系统在41°C、80 mM Mg²⁺条件下性能最优，检测限达20拷贝/μL。

3.2 性能验证

凝胶电泳显示320:1引物比例时ssDNA产量最大（图2）。与荧光RPA相比，OAR-MNA特异性100%，且能区分近缘种A. avenae subsp. avenae（图4）。在22份西瓜种子样本中与qPCR结果完全一致（图5）。

3.3 扩展应用

通过替换RT-RPA，该系统成功检测RNA病毒黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV），验证了平台普适性（图S24-S26）。

3.4 现场适配性

自主研发的便携分析仪（74×74×76 mm）整合温控与荧光检测模块，成本降至2.16美元/测试，较传统方法降低50%（图6）。

4 结论

OAR-MNA突破了ssDNA生成的技术瓶颈，实现闭管检测且无需复杂设备。未来将通过多重检测和免提取优化进一步提升实用性，为农业生物安全提供创新解决方案。