综述：膜蛋白与蛋白质复合物研究中19F NMR的最新应用

　　本综述系统总结了19F NMR（氟核磁共振）技术在膜蛋白和蛋白质复合物研究中的前沿进展，重点探讨了新型氟化探针开发、非经典氨基酸标记策略、顺磁效应应用以及氟化片段库构建等方向，为动态构象研究和药物发现提供了关键技术支撑。

　　

Abstract

氟核磁共振（¹⁹F NMR）已成为研究蛋白质及其复合物动态构象集合的关键光谱学工具。该技术不仅能够通过蛋白质观测模式（PrOF）揭示构象变化，还可通过配体观测模式推动基于片段的药物发现（FBDD）。近年来，该领域在氟化报告基因设计、非经典氟化氨基酸探针开发、顺磁效应引入以及氟化片段库构建等方面取得显著进展，特别在膜蛋白和大分子复合物等挑战性靶点研究中展现出独特优势。

Introduction

结构生物学通过冷冻电镜（cryo-EM）、X射线晶体学及深度学习算法（如AlphaFold和RoseTTAFold）获得了大量高分辨率蛋白质结构。然而，蛋白质的功能实现往往依赖于动态构象集合，其拓扑结构、寿命和变构特性直接影响配体结合效能与治疗结局。¹⁹F NMR通过位点特异性氟标记或生物合成氟化氨基酸嵌入，能够有效解析蛋白质的动态构象集合，弥补静态结构信息的不足。此外，传统高通量筛选技术（如ASMS或DNA编码库）存在假阳性率高、二次验证繁琐等瓶颈，而¹⁹F NMR凭借其对分子环境的极端敏感性，成为功能状态监测和先导化合物筛选的关键工具。

1 Monitoring ligand- and fragment-binding through Protein-Observed ¹⁹F NMR

¹⁹F NMR具有高灵敏度和化学位移敏感性，可分辨微秒至秒级动态过程，包括构象异构体区分、配体结合事件及功能相关动力学。目前氟化标记策略主要包括三类：

1）生物共价标记：通过硫醇反应性标签（如TFET、BTFMA、TFP等）特异性修饰半胱氨酸残基，但需避免非目标位点标记；

2）生物合成标记：利用细胞氨基酸代谢缺陷型菌株或内源性氨酰tRNA合成酶的底物包容性，实现残基特异性氟化氨基酸（如5FTrp）嵌入，其中5-氟吲哚转化为5-氟色氨酸（5FTrp）的策略在大肠杆菌和毕赤酵母系统中均获成功；

3）遗传密码扩展（GCE）：通过正交翻译系统（OTS）将非经典氨基酸（如三氟甲基苯丙氨酸mtfF）定点插入蛋白质序列，虽存在蛋白产量降低挑战，但可通过优化密码子使用或改造抑制型tRNA改善。

值得注意的是，氟化标记结合¹³C等核素可实现多维相关实验（如¹⁹F–¹³C HSQC），为大分子复合物提供更丰富结构信息。例如，Tan等人将氟亮氨酸嵌入肽基脯氨酰异构酶B，通过二维NOESY和HOESY实验解析局部构象动态；Frkic团队利用¹³C标记的C^γH₂F-Val研究异构酶旋转构象偏好；Suleiman则通过¹³C–¹⁹F TROSY技术提升二聚酶FAcD的分辨率。

PrOF方法通过线形分析、弛豫测量（T₁/T₂）及CPMG弛豫分散实验探测配体结合引起的动态变化，已应用于蛋白质折叠、低亲和力配体结合及二聚化动力学研究。在膜蛋白领域，GPCR及其G蛋白复合物中战略位点的氟标记成功揭示了激动剂、拮抗剂和变构调节剂引起的构象状态转换。例如：

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  人源大麻素受体CB1研究中，通过PylRS系统将mtfF嵌入M337^6.29和A398^7.54位点，发现激动剂和拮抗剂结合导致明显化学位移变化，识别出至少四种构象状态（P1/P2/P3和Q1/Q2），并揭示变构调节剂Org27569与胆固醇协同调控受体活性的机制；

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  β-抑制蛋白1（β-arrestin-1）研究中，通过半胱氨酸标记发现磷脂酰肌醇PIP₂结合诱导C端结构域变构，激活信号传递至30?外的N/C端界面（E313C、D240C、C242位点动力学增强50%）。进一步采用¹⁹F CEST实验捕获到短暂存在的中间态S*，证实PIP₂通过调控CT和TE区域构象平衡促进部分激活。

Ligand NMR and fragment based drug discovery

面对超过10⁶⁰理论药物样分子的化学空间，片段药物发现（FBDD）通过小规模库筛选逐步优化片段连接策略。¹⁹F NMR在此领域具独特优势：

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  氟化片段库（如CF₃、SFA、SF₄等）可通过化学位移变化（Δδ）直接检测结合事件，灵敏度达μM-mM级；

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  竞争性实验可区分特异性结合与假阳性，例如三氟甲基片段与碳酸酐酶结合研究中，化学位移扰动与结合亲和力呈正相关；

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  顺磁弛豫增强（PRE）技术通过添加顺磁试剂（如Gd³⁺）加速配体信号衰减，快速区分结合态与游离态，显著提升筛选效率。

Utilization of paramagnetic reagents to evaluate ligand and protein topologies and dynamics.

尽管¹⁹F NMR化学位移难以从结构模型预测，但顺磁试剂的应用为拓扑和动态分析提供新途径：

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  顺磁弛豫增强（PRE）和伪接触化学位移（PCS）可定量分析配体-蛋白质相互作用距离和取向，例如Gd³⁺标记的蛋白质可诱导结合配体信号衰减，而未结合配体保持尖锐峰；

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  双报告基因策略（如顺磁探针与¹⁹F探针正交标记）可同时获取距离与动态信息，特别适用于膜蛋白系统；

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  机器学习模型（如NMRnet）开始用于氟化分子化学位移预测，提升数据解析效率。

Overview

¹⁹F NMR技术通过不断创新标记策略、整合顺磁效应及优化片段库设计，已成为研究膜蛋白和蛋白质复合物动态构象的核心手段。其在GPCR信号转导、变构调控机制及片段药物筛选中的应用，不仅深化了对蛋白质功能 ensemble 的理解，更为靶向难治性疾病的新型药物开发提供了强大技术平台。未来发展趋势包括开发高灵敏度CF₃报告基因、优化遗传编码系统提升标记效率，以及结合人工智能实现化学位移精准预测。