临床宏基因组测序技术在不明原因发热患者全血病原体检测中的开发与性能评估

　　这篇研究开发了一种创新的宏基因组下一代测序（mNGS）工作流程，通过整合血浆和全血样本预处理策略（SISPA扩增、宿主rRNA/mRNA去除），实现了单次测序同时检测细胞内/游离病原体（灵敏度79.5%）。独创的ClinSeq评分系统（κ=0.61）显著提升生物信息学分析效率，为不明原因发热的快速临床诊断提供了标准化解决方案。

　　

Introduction

急性不明原因发热的诊断长期面临挑战，传统血培养仅能确诊15%病例，而靶向PCR需预先锁定可疑病原体。本研究针对这一临床痛点，开发了整合血浆（DNase处理+宿主RNA去除）与全血（直接逆转录）双路径的mNGS工作流程。通过序列非依赖性单引物扩增（SISPA）技术，首次实现在单次建库中同步捕获DNA/RNA病原体，尤其提升了对巴尔通体（Bartonella quintana）等难培养细菌和登革病毒（DENV）等RNA病毒的检测能力。

Materials and methods

200例经分子诊断确诊的EDTA抗凝血样本（含79例细菌、15例DNA病毒、103例RNA病毒）被纳入验证。创新性样本处理流程包括：

1. 1.

   血浆组分经Turbo DNase消化后，采用稀释10倍的QIAseq试剂去除宿主rRNA/球蛋白mRNA

2. 2.

   全血组分直接进行SISPA-A扩增保留细胞内病原体信号

3. 3.

   双平台测序（Illumina/ONT）后，通过自研生物信息学管道（KrakenUniq分类）生成数据

   关键突破是ClinSeq评分算法：综合kmer覆盖率（C）、重复度（D）等参数，通过动态阈值（均值+0.6×标准差）实现自动化病原体排序，较传统人工分析节省90%时间。

Results

整体灵敏度达79.5%，其中细菌检测表现最优（88.6%），尤以嗜吞噬细胞无形体（A. phagocytophilum）检出率最高（56/57）。RNA病毒检测中，普马拉病毒（PUUV）和蜱传脑炎病毒（TBEV）分别实现75%和78%灵敏度。值得注意的是：

• •

  当Ct值<30时，检出成功率显著提升（ΔCt=6.1）

• •

  纳米孔（ONT）与Illumina平台灵敏度相当（79.1% vs 80.0%）

• •

  ClinSeq评分在63%样本中准确识别病原体，且假阳性率为零

Discussion

该工作流程的创新性体现在三方面：

1. 1.

   湿实验环节通过物理分离（血浆/全血）与差异处理，兼顾胞内菌（如巴尔通体）和游离病毒颗粒的检测

2. 2.

   干实验采用自适应阈值算法，克服了传统固定阈值在低丰度样本（Ct>30）中的应用局限

3. 3.

   经济性显著提升，较平行建库方案降低成本约40%

局限性在于对某些特殊病原体（如柯克斯体C. burnettii）检测效率较低，可能与样本中病原体基因组完整性有关。与Guellil算法相比，ClinSeq评分灵敏度提升达41个百分点，但其在混合感染场景中的性能仍需进一步验证。

Conclusion

本研究建立的mNGS全流程为不明原因发热提供了"一站式"诊断方案，尤其适合资源有限地区。未来可通过引入机器学习优化ClinSeq评分的权重参数，并探索其在脑脊液等复杂样本中的应用潜力。该技术路线有望重塑发热待查的临床诊断路径。