钩藤碱通过AhR-NR4A1通路修复肠道屏障完整性及缓解炎症性肠病的机制研究

　　本研究揭示传统中药钩藤活性成分钩藤碱（Rhy）通过激活AhR-NR4A1信号通路，上调紧密连接蛋白（Claudin4/Occludin/ZO-1）表达，显著改善DSS诱导的小鼠急慢性结肠炎症状。实验证实Rhy兼具抗炎与屏障修复双重功能：体外降低IL-6/TNF-α/NO水平（p<0.05），体内减少结肠缩短（23.7%）及血清炎症因子（CXCL1↓41.2%）。分子动力学模拟显示Rhy与AhR结合能达-35.25 kcal/mol，为IBD治疗提供新型低毒AhR配体策略。

　　

背景

炎症性肠病（IBD）的核心病理特征包括肠道黏膜屏障破坏与异常免疫激活。钩藤碱（Rhy）作为传统中药钩藤的主要生物碱成分，既往研究多聚焦其降压、抗肿瘤作用。本研究首次系统阐释Rhy通过AhR-NR4A1通路双向调控肠道屏障修复与炎症缓解的创新机制。

方法

研究采用三重验证体系：

1. 1.

   体外模型：LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症（50 ng/mL）与DSS损伤NCM460/Caco-2细胞（2%），检测IL-6/TNF-α（ELISA）及跨膜电阻（FITC-葡聚糖渗透实验）

2. 2.

   动物实验：C57BL/6J小鼠构建急性（3% DSS 7天）与慢性（4周期2% DSS）结肠炎模型，设低中高剂量组（2/4/8 mg/kg）

3. 3.

   机制探索：转录组测序（Biotree公司）筛选差异基因，结合AhR/NR4A1基因敲除（siRNA转染）与分子动力学模拟（Autodock Vina 1.1.2）

结果

3.1 抗炎与屏障增强效应

Rhy在0.5 μM浓度即可抑制LPS诱导的IL-6分泌（下降62.3%），5 μM显著促进NCM460增殖（OD₄₅₀值提升1.8倍）。共聚焦显微镜显示Rhy处理组Claudin4荧光强度增加3.2倍（p<0.01），EdU实验证实肠上皮细胞增殖率提高47.5%。

3.2-3.4 结肠炎改善效果

在急性模型中，Rhy-H组（8 mg/kg）使DAI评分降低4.1分，结肠长度恢复至7.2±0.3 cm（模型组5.8±0.4 cm）。慢性模型显示Rhy持续降低MPO活性（62.7 U/g→38.4 U/g），Western blot检测ZO-1蛋白表达上调2.1倍。预防性给药较治疗性给药更有效（FITC渗透率低31.4%）。

3.5-3.6 分子机制解析

关键发现包括：

• •

  AhR激活：分子对接显示Rhy与AhR的PAS结构域形成氢键（LYS-242）和疏水作用（PHE-170/220），结合自由能-35.25 kcal/mol

• •

  NR4A1调控：RNA-seq鉴定215个差异基因，NR4A1表达上调2.5倍（KEGG富集于PI3K-Akt通路）

• •

  双依赖效应：AhR/NR4A1敲除后，Rhy对ZO-1的诱导作用完全消失（p<0.001）

讨论

研究突破点在于揭示Rhy通过"AhR-CYP1A1-NR4A1"级联反应实现：

1. 1.

   直接调控：AhR核转位激活XRE元件转录

2. 2.

   代谢转化：CYP1A1介导生成11-羟基化活性代谢物

3. 3.

   表观修饰：NR4A1抑制NF-κB通路减轻炎症

与经典AhR激动剂FICZ相比，Rhy（EC₅₀=50 μM）虽活性较低但无毒性优势，其屏障修复作用可持续至停药后72小时。

结论

该研究为IBD治疗提供新型"屏障-炎症"双靶点策略，钩藤碱作为天然AhR调节剂，在酒精性肝病、神经退行性疾病等领域具有潜在转化价值。后续研究将聚焦CYP1A1基因敲除动物模型的验证工作。