双探针芯片数字PCR技术的建立及其在猪δ冠状病毒与猪流行性腹泻病毒同步检测中的应用

　　本研究建立了一种新型双探针芯片数字PCR（cdPCR）技术，可同步定量检测猪δ冠状病毒（PDCoV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）。该方法灵敏度极高（PDCoV检测限1.83±0.15 copies/μL，PEDV 0.99±0.07 copies/μL），特异性强（与TGEV/PSV/PRV无交叉反应），线性优异（R2>0.996），为混合感染及气溶胶样本的早期监测提供了精准工具。

　　

1 引言

猪δ冠状病毒（PDCoV）与猪流行性腹泻病毒（PEDV）是引发生猪致死性腹泻的主要病原体，混合感染率在中国部分地区高达60%。两者除粪口传播外，气溶胶传播证据日益明确——PDCoV可通过密闭环境气溶胶感染，PEDV能经CD3⁺T细胞携带至肠道。现有检测方法难以满足低载量样本和混合感染的精准监测需求，而芯片数字PCR（cdPCR）凭借纳米级反应单元分割和泊松统计原理，可实现绝对定量且不受扩增效率干扰。

2 材料与方法

研究采用PDCoV HNZK-02株和PEDV HN-2021株，针对N基因（PDCoV）和M基因（PEDV）设计FAM/HEX双标记探针。通过梯度测试确定最佳退火温度（58°C）和引物-探针浓度比（800 nM/1000 nM）。临床样本经TRIzol裂解后提取RNA，气溶胶采样使用ASP-200p设备在0-2米范围收集。

3 结果

3.1 反应体系优化

二维散点图显示FAM（PDCoV）与HEX（PEDV）信号无交叉，阳性/阴性液滴分离显著。800 nM/1000 nM浓度比下荧光振幅差异最大。

3.2 灵敏度与特异性

检测下限达单拷贝水平，显著优于qPCR（PDCoV 1.83 vs 12.6 copies/μL）。特异性验证中仅目标病毒产生信号，与TGEV等病原体无交叉。

3.3 临床应用

148份腹泻样本检出PDCoV单阳率18.92%，PEDV 23.65%，混合感染8.11%。4例qPCR阴性但cdPCR阳性样本经超速离心浓缩后均转为qPCR阳性，证实cdPCR对低载量样本的检测优势。

3.4 气溶胶监测

攻毒24小时后，感染组0米处气溶胶病毒载量达10⁵ copies/m³，2米处降低10倍。废弃6个月的猪场粪沟上方仍可检出病毒核酸。

4 讨论

该技术突破传统qPCR依赖标准曲线的局限，为混合感染鉴别、环境生物气溶胶风险评估提供新工具。尤其值得注意的是，其检测气溶胶中病毒的能力为传播机制研究开辟新途径。未来可拓展至其他共流行冠状病毒的同步监测，助力生猪疫病防控体系建设。

5 结论

双探针cdPCR技术实现了PDCoV/PEDV的超敏同步检测，在疫病早期预警和环境监测中具有重要应用价值。