基于纳流、毛细管流和微流色谱分离的高性能蛋白质组学研究

　　为解决蛋白质组学分析中不同样本类型对灵敏度和通量的差异化需求，研究人员系统评估了0.3–50 μL/min流率范围内色谱分离的性能，发现毛细管流LC-MS/MS（capLC, 1.5 μL/min）在灵敏度、定量性和稳健性上可替代传统纳流LC（nLC），为临床队列和药物靶点研究提供了高效解决方案。

　　

蛋白质组学技术在过去30年依赖纳流液相色谱-质谱联用（nLC-MS/MS），因其超高灵敏度成为小样本分析的黄金标准。然而，随着临床队列研究和药物筛选对高通量的需求激增，高流率系统（如微流LC-MS/MS）因更快的分析速度和更强的稳定性重新受到关注。但不同流率系统间的性能差异缺乏系统性比较，实验室常面临“选择困难”——是牺牲灵敏度换取通量，还是反之？

德国慕尼黑工业大学的Giorgi Tsiklauri团队在《Journal of Proteome Research》发表的研究填补了这一空白。他们利用Vanquish Neo LC系统（支持1 nL/min至100 μL/min无硬件更换）和Q Exactive HF-X质谱仪，首次对μLC（50 μL/min）、capLC（1.5–10 μL/min）和nLC（0.3 μL/min）进行了同平台比对。通过HeLa细胞裂解液稀释系列、磷酸化肽段富集和激酶抑制剂AT-9283的Kinobeads pull-down实验，揭示了三大发现：所有流率均能实现高质量分析；capLC在1.5 μL/min时兼具nLC的灵敏度与μLC的稳定性；不同流率适用于不同场景，如μLC适合血浆大队列，而nLC仍是单细胞研究的首选。

关键技术方法

研究采用统一平台（Vanquish Neo HPLC + Q Exactive HF-X）比较5种流率，色谱柱均为150 mm长Acclaim PepMap Neo C18（2 μm/100 ?），仅内径不同（75 μm至1 mm）。样本包括HeLa细胞裂解液（5 ng–10 μg）、IMAC富集的磷酸化肽段和Kinobeads捕获的药物-蛋白复合物。数据依赖采集（DDA）模式分析，MaxQuant处理数据，通过肽段/蛋白鉴定数、峰宽（FWHM）和定量精密度等指标评估性能。

研究结果

1. 1.

   灵敏度对比

   在200 ng样本量下，1.5 μL/min capLC的肽段强度比50 μL/min μLC提升13倍，且因更窄的色谱峰（中位峰宽6.1秒 vs nLC的8.1秒）和更高峰容量（294 vs 200），蛋白鉴定数反超nLC。

2. 2.

   多喷嘴电喷雾源测试

   5 μL/min流率下，8喷嘴MnESI源使肽段鉴定数增加16%，但1.5 μL/min时性能下降，提示喷嘴尺寸需与流率匹配。

3. 3.

   稳健性验证

   100次连续进样中，1.5 μL/min capLC的保留时间CV<0.7%，血浆样本携带率仅0.48%，蛋白定量CV<20%的占比达98%。

4. 4.

   应用实例

   磷酸化蛋白质组分析中，capLC鉴定磷酸肽数比nLC多21%；Kinobeads实验测得药物靶点pEC₅₀值与nLC高度相关（r=0.95），证实其定量可靠性。

结论与意义

该研究首次建立跨流率蛋白质组分析的金标准，证明1.5 μL/min capLC是多数应用的“甜点”——其平衡了nLC的灵敏度与μLC的耐用性，尤其适合中通量需求（如磷酸化修饰分析或药物靶点筛选）。对于超高通量（如COVID-19血浆标志物筛查）或超微量样本（单细胞），μLC和nLC仍不可替代。这一成果为实验室选择色谱系统提供了实证依据，推动蛋白质组学向更精准、更高效的方向发展。