综述：第三代测序技术在肝细胞癌肝移植精准医学中的应用与展望

　　这篇综述系统阐述第三代测序技术(TGS)如何革新肝细胞癌(HCC)肝移植(LT)全程管理，通过长读长测序(SMRT/Nanopore)实现超越米兰标准的分子分层(如SV负荷、基因融合)、ctDNA超早期复发监测(灵敏度达0.02%)及表观遗传分析(5mC直接检测)，为移植候选者筛选、个体化辅助治疗(如MET抑制剂)和排斥反应预警(dd-cfDNA)提供全新解决方案。

　　

第三代测序技术概述

以单分子实时测序(SMRT)和纳米孔测序(ONT)为代表的第三代测序技术，凭借>10 kb的超长读长、直接检测表观修饰(如5-甲基胞嘧啶)和实时分析能力，正在重塑肝细胞癌(HCC)肝移植(LT)的临床决策范式。SMRT技术通过零模波导孔(ZMWs)捕获DNA聚合酶合成荧光信号，而ONT利用纳米孔电流变化识别核苷酸序列，两者均规避了传统PCR扩增偏差，为复杂基因组结构变异(SV)和融合基因检测提供利器。

移植前决策：超越米兰标准的分子分层

基因组结构变异负荷

HCC基因组以高频SV为特征，包括插入(INS)、缺失(DEL)和易位(TRA)等。纳米孔测序在11例HCC样本中发现420个短读长测序漏检的SV，其中转座子/Alu插入和非等位同源重组(NAHR)缺失与侵袭性表型显著相关。SV负荷可作为独立预后指标，为扩大米兰标准的分子改良提供依据。

基因融合驱动事件

LINE1-MET和HBV-转座元件嵌合体等融合转录本通过长读长测序被首次发现，这些事件促使原本不符合移植指征的患者经MET抑制剂(如Savolitinib)新辅助治疗后获得移植机会。

表观遗传图谱

CpG位点cg02746869的甲基化状态与微血管侵犯(MVI)和早期复发风险相关。TGS直接检测5mC的特性避免了亚硫酸氢盐处理的DNA降解，结合液体活检可实现无创MVI评估。

移植后管理：复发预警与免疫监控

ctDNA动态监测

纳米孔技术将TP53突变检测灵敏度提升60倍(最低0.02%)，结合浅层全基因组测序(sWGS)可同步分析拷贝数变异(CNV)和甲基化特征。CNV负荷与复发风险显著相关，甲基化数据进一步强化预测效能。

免疫排斥双维评估

T细胞受体(TCR)克隆追踪通过纳米孔测序实现，其与Illumina数据高度吻合(R=0.992-0.996)。供体来源游离DNA(dd-cfDNA)检测比传统肝功能检查更早预警排斥反应，而病原体快速鉴定(如CMV/EBV)可区分感染与排斥。

技术挑战与临床转化

当前TGS面临原始读长错误率较高(6-10%)的问题，但共识序列校正后准确性显著提升。自动化流程和成本降低(如ONT便携设备)加速了临床落地，但FDA/CE-IVD认证缺失和40%新发SV的临床意义不明仍是主要障碍。多中心前瞻性验证和AI辅助分析(如Nano2NGS-Muta算法)将成为推动TGS整合入LT-HCC标准诊疗的关键。

未来展望

跨学科融合将深化对HCC异质性的认知，而基于TGS的个体化治疗策略(如甲基化抑制剂联合放疗)有望改善移植预后。随着长读长测序成本持续下降和生物信息学工具优化，分子指导的精准肝移植时代正在到来。