基于CAViTs方法构建多层3D基质屏障模型定量分析T细胞浸润与细胞毒性

　　为解决肿瘤微环境(TME)中免疫细胞浸润障碍问题，研究人员利用细胞组装粘性组织(CAViTs)技术构建了可空间区室化癌细胞与基质成分(包括成纤维细胞和内皮细胞)的多层3D基质模型。该研究首次实现了对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)浸润和杀伤作用的定量分析，并证实组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂可通过下调ECM组分增强T细胞穿透能力，为免疫治疗药物筛选提供了可调谐、可重复的体外研究平台。

　　

在癌症免疫治疗领域，免疫检查点抑制剂(ICIs)和过继性T细胞治疗(ACT)虽已取得显著成效，但"冷肿瘤"微环境中T细胞浸润不足仍是重大挑战。肿瘤相关基质细胞尤其是癌症相关成纤维细胞(CAF)通过形成物理屏障和分泌免疫抑制因子，构成了阻止T细胞浸润的多重防线。传统3D培养模型难以精确模拟肿瘤细胞与基质细胞的空间组织关系，更缺乏定量评估免疫细胞穿透能力的标准化平台。

为解决这一技术瓶颈，Rii Morimura团队创新性地采用了细胞组装粘性组织(CAViTs)技术。该研究使用人结肠癌细胞系(HCT15/β₂m)、正常人真皮成纤维细胞和脐静脉内皮细胞(HUVEC)构建多层3D模型，通过TGFβ和抗坏血酸诱导CAF表型。关键技术包括：1)基于Transwell的3D共培养系统建立；2)AKF9新抗原特异性TCR-T细胞的制备与功能验证；3)活细胞成像动态追踪T细胞迁移；4)Luminex多重检测分析趋化因子分泌谱；5)RNA测序解析HDAC抑制剂对CAF的调控机制。

3.1 3D免疫模型的构建

研究人员通过CAViTs方法成功实现了癌细胞在基质中的精确定位，与传统球体培养相比，该模型更真实模拟了体内肿瘤组织结构。当与特异性识别AKF9表位的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)共培养时，活细胞成像显示T细胞呈现趋化性迁移，在72小时内形成类似"淋巴热点"的聚集区。值得注意的是，3D-in组(癌细胞嵌入基质内部)的细胞毒性显著低于直接接触的2D组和3D-on组，证实了基质屏障的免疫屏蔽作用。

3.2 CTL活性的验证

通过阻断HLA I类分子，研究人员证实T细胞对癌细胞的识别严格依赖MHC-抗原肽复合物。多重因子检测发现CXCL9/10和CCL3/4/5等趋化因子特异性高表达于CTL与靶细胞共培养组，揭示了免疫细胞招募的分子机制。

3.3 CAF模型的建立

TGFβ诱导的CAF表现出典型的α平滑肌肌动蛋白(αSMA)高表达和ECM相关基因上调。该模型成功模拟了"冷肿瘤"特征：在CAF富集的3D组织中，TCR-T细胞的浸润效率下降83%，且主要滞留于组织表层。

3.4 药物筛选与验证

从抑制剂库中筛选发现，组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)可使T细胞杀伤效率提升3.2倍。协同作用分析显示，选择性抑制HDAC1-3的entinostat同样有效，而特异性靶向HDAC6的RGFP966则无此效应，提示该作用具有亚型选择性。

3.5 机制解析

RNA测序揭示TSA和entinostat可显著下调319个CAF相关基因，特别是胶原蛋白COL1A1等ECM成分。Western blot证实这两种抑制剂在2D和3D模型中均能降低αSMA和COL1A1蛋白水平，表明其通过"CAF正常化"机制改善免疫浸润。

这项研究构建了首个能同时模拟"热肿瘤"和"冷肿瘤"特征的模块化3D平台，其创新性体现在：1)空间可控的肿瘤-基质共培养系统；2)整合活细胞成像的定量分析方法；3)可用于高通量药物筛选的标准化流程。发现HDAC抑制剂通过调控CAF的ECM重塑功能增强T细胞浸润，为联合免疫治疗提供了新策略。未来研究可进一步整合肿瘤相关巨噬细胞(TAM)等免疫抑制组分，使模型更接近体内复杂微环境。该成果为克服实体瘤免疫治疗耐药性提供了重要工具和理论依据，相关技术已申请专利保护。