体外BRAF激活实验揭示自抑制状态解聚的分子机制及其在癌症治疗中的意义

　　（编辑推荐）本研究通过体外BRAF激活实验系统，揭示了KRAS结合不仅介导BRAF膜定位，更通过破坏RBD:14-3-3界面触发自抑制单体解聚，进而促进二聚化激活。该研究为靶向RAS-ERK（RAF-MEK-ERK）通路的药物开发提供了新视角，尤其对BRAF突变相关癌症和RASopathy（RAS病变）的治疗策略具有重要启示。

　　

分子机制解析：KRAS如何撬动BRAF自抑制状态

RAF激酶家族（ARAF/BRAF/CRAF）作为RAS-ERK信号通路的核心效应器，其激活异常与多种癌症和RASopathy发育障碍密切相关。最新研究通过体外重构实验，首次捕捉到KRAS结合触发BRAF自抑制复合物（BRAF:14-3-3₂:MEK）解聚的关键动态过程。

RBD:14-3-3界面的电荷博弈

分子动力学模拟显示，自抑制状态下BRAF的RAS结合域（RBD）与14-3-3蛋白形成435?²的稳定界面，其中K182残基与14-3-3的E208/Y211等形成持久氢键。当活性态KRAS（GppNHp结合型）介入时，其Switch I区的酸性残基（D30/E31）与14-3-3的D197/E198产生静电排斥，同时引发空间位阻，如同"分子撬棍"般破坏原有界面。

膜微环境的协同效应

体外激活实验揭示：

1. 1.

   单独KRAS-FMe（法尼基化甲基化修饰）可使BRAF活性提升8-10倍，且呈剂量依赖性

2. 2.

   含30%磷脂酰丝氨酸（PS）的脂质体使激活效果倍增，达到组成型二聚体BRAF的活性水平

3. 3.

   KRAS膜锚定实验证实，纳米圆盘（nanodisc）上固定的6个KRAS分子即可实现等效激活

SMP磷酸酶的精准调控

SHOC2/MRAS/PP1（SMP）复合物对BRAF催化活性影响微弱（≤10%增幅），但能特异性去磷酸化负调控位点pS365。有趣的是，KRAS和PS脂质体的存在使pS365去磷酸化效率提升3倍，暗示膜微环境可暴露隐蔽的磷酸化位点。

物种来源的关键差异

对比不同表达系统发现：

• •

  Sf9昆虫细胞产生的BRAF复合物因S151等ERK反馈磷酸化位点高修饰（95% vs Tni-FNL的13%），导致RBD流动性增加、基线活性偏高

• •

  Tni-FNL系统复现了人源293FT细胞的稳定自抑制状态，其3.8?冷冻电镜结构显示RBD:14-3-3界面与天然构象完全一致

药物开发新策略

基于该体系的筛选发现：

1. 1.

   RAS结合域（RBD）竞争剂可剂量依赖性抑制激活（WT RBD IC₅₀=1μM，而R188L突变体无效）

2. 2.

   变构抑制剂avutometinib通过稳定自抑制构象阻断激活

3. 3.

   KRAS抑制剂BI-2852（靶向Switch I/II口袋）在10μM浓度下完全阻断信号传导

这项研究不仅阐明了"RAS结合→膜招募→自抑制解除→二聚化"的级联激活机制，更建立了可模拟生理条件的药物筛选平台，为攻克BRAF突变肿瘤和RAS信号异常疾病提供了全新干预思路。