猕猴皮层Utah光极阵列（UOA）急性植入的皮质响应：优化设计以减少组织损伤并提升长期生物相容性

　　本文系统研究了猕猴皮层中Utah光极阵列（UOA）急性植入引起的组织反应，聚焦于探针直径、表面纹理/尖端几何形状及插入压力等关键参数对星形胶质细胞（GFAP）、小胶质细胞（Iba1）激活及神经元存活（NeuN）的影响。结果表明，较小直径（如60μm）、光滑表面及圆钝尖端设计的UOA引起的炎症反应最轻，神经元损伤最小，而较高插入压力主要导致组织压缩而非显著炎症。该研究为优化UOA设计以平衡光传递效率与组织生物相容性提供了重要依据，对推进非人灵长类（NHP）光遗传学应用及神经接口技术的临床转化具有指导意义。

　　

1 引言

光遗传学（Optogenetics）已彻底改变神经环路功能研究，但其在非人灵长类（NHP）等大脑体积物种中的应用仍受限。主要挑战在于如何以高时空精度将光传递至深部神经组织大体积区域，同时避免影响浅表组织。为克服这些限制，研究团队近期开发并在NHP皮层中体内测试了Utah光极阵列（Utah Optrode Array, UOA）。该阵列由10×10穿透性玻璃针组成，覆盖4×4 mm²区域，结合交错排列的针对齐和间隙μLED阵列，可独立光刺激深部和浅表组织。本研究旨在探究UOA植入NHP皮层后的急性生物响应，以优化设备设计，减少插入创伤并改善慢性响应。通过系统改变UOA的探针直径、表面纹理/尖端几何形状及插入压力，评估其对星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元存活的影响。

2 结果

2.1 Utah光极阵列（UOA）

UOA为10×10穿透性玻璃光学针阵列，可定制长度（达2.5 mm）和宽度（60-120 μm），针间距400 μm。其“主动”形式键合电可寻址μLED阵列，允许通过各针尖独立传递光，以及9×9 μLED阵列用于针间表面照明。UOA基于Utah电极阵列（UEA）几何结构，但针宽更小且无锥度（防止光泄漏），尖端几何形状可从尖锐至圆钝。更圆钝尖端提供更高峰值辐照度和深部照明，而更尖锐尖端则辐照度较低且呈侧向照明轮廓。制造过程需平衡表面粗糙度（影响光耦合效率）与尖端圆度（影响组织穿透性）。研究选用两种几何结构：光滑/圆钝（经725°C退火2小时）和粗糙/尖锐（未退火）。第二代UOA加入光学不透明中介层，带圆形通孔对应针位，确保光仅通过针尖传递，避免表面照明和针间串扰。研究共植入16个“被动”UOA（无集成μLED），参数包括针直径（60、85或100 μm）、表面纹理（光滑或粗糙）/尖端几何形状（圆钝或尖锐），针长1.3-1.7 mm。插入使用高速气动锤，压力9-20 psi，脉冲宽30或50 ms，部分插入（使用1 mm垫片），植入1-3小时后取出。

2.2 宏观检查

植入后，粗糙/尖锐及较大直径（100 μm）UOA通常引起更多出血，而光滑/圆钝及较小直径UOA出血较少。所有UOA导致最小脑水肿，部分可见针道微出血，限于针道数毫米内，粗糙/尖锐UOA植入位点更明显。

2.3 显微镜检查：胶质响应与神经元存活

2.3.1 星形胶质细胞激活

通过胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组化评估星形胶质细胞激活。GFAP免疫反应性在针道周围增加，主要于浅层皮层（L1-2），形成密集星形胶质细胞层。定性上，GFAP免疫反应性随UOA针直径增加而升高，且各直径下粗糙/尖锐UOA高于光滑/圆钝UOA。定量显示，GFAP积分密度（标准化至对照位点）随针直径和粗糙度/尖锐度增加而增加。较小直径（60 μm）光滑/圆钝UOA引起轻微星形胶质细胞激活，而较大直径（100 μm）粗糙/尖锐UOA激活显著。插入压力分析显示，仅粗糙/尖锐几何下GFAP积分密度与压力呈正相关（r=0.71, p=0.0257），光滑/圆钝几何无显著相关。

2.3.2 小胶质细胞激活

通过离子钙结合适配器分子（Iba1）免疫组化评估小胶质细胞/巨噬细胞激活。Iba1免疫反应性在浅层皮层（L1-2）增加，深层仅100μm直径UOA引起显著增加。100μm直径UOA导致更高小胶质细胞激活，而60μm和85μm直径UOA间无显著差异。针几何形状对小胶质细胞激活影响较小，但较小直径下光滑/圆钝几何略高激活。Iba1积分密度与针直径呈强正相关（光滑/圆钝r=0.99; 粗糙/尖锐r=0.96），总体相关显著（r=0.9, p=0.0071）。插入压力与小胶质细胞激活无显著相关。

2.3.3 神经元存活

通过神经元核蛋白（NeuN）免疫组化评估神经元存活。光滑/圆钝UOA中，较大直径（85μm和100μm）减少NeuN免疫反应性，而60μm直径无变化或轻微增加。粗糙/尖锐UOA中，60μm和85μm直径减少NeuN免疫反应性，但100μm直径增加NeuN免疫反应性（可能因组织压缩）。NeuN积分密度与插入压力呈正相关（r=0.63, p=0.0103），表明压力增加导致组织压缩和神经元密度表观增加。

3 讨论

研究识别出UOA设计中的关键因素：针直径和表面纹理/尖端几何形状最影响组织损伤。较大针直径导致更大组织损伤，引起更高星形胶质细胞和小胶质细胞激活，并降低神经元存活。光滑纹理和圆钝尖端有助于减少星形胶质细胞激活并保存神经元存活（针对较小直径UOA），但针对最大直径（100μm）UOA，粗糙/尖锐几何损伤较小，可能因尖锐尖端更易穿透组织。较高插入压力对炎症响应影响有限，但导致更大组织压缩。因此，平衡针直径、几何形状和插入压力对有效、组织友好UOA设计至关重要。

3.1 针直径影响

60μm直径光滑/圆钝UOA引起损伤最小，仅浅层皮层轻微胶质激活，无神经元存活减少。较大针直径导致更高星形胶质细胞和小胶质细胞激活，因更大物理组织破坏。但较大直径允许更高效光耦合（光遗传应用需），代表光传递与组织完整性间权衡。

3.2 表面纹理和尖端几何形状影响

光滑表面可能减少插入摩擦，从而最小化机械创伤和炎症响应。圆钝尖端允许更温和插入路径，局部化应力。针对较小直径，光滑/圆钝几何最小化星形胶质细胞激活和炎症响应，并更好保存神经元存活；但小胶质细胞激活似乎偏好粗糙/尖锐几何。针对100μm直径，粗糙/尖锐几何最小化胶质激活，因尖锐尖端易穿透。神经元存活结果表明，较小直径光滑/圆钝UOA更有效保存神经元密度。

3.3 插入压力影响

UOA插入需高速（≥8.3 m/s）和高压（25-29 psi）。本研究压力9-20 psi。较高压力导致更大机械应力，星形胶质细胞激活增加（粗糙设计），但小胶质细胞不受影响。神经元存活表明压力增加导致组织压缩和神经元密度表观增加。压力响应变异可能受其他物理参数影响。

4 结论

研究强调平衡UOA设计对优先考虑有效性、可靠性和安全性的重要性。优化表面和尖端设计结合受控插入压力增强UOA组织稳定性，同时保存组织完整性，为光遗传和神经刺激应用中改进长期性能建立基础。较小直径、光滑表面和圆钝尖端UOA引起损伤最小，但可能深部光传递效率较低。100μm直径UOA先前显示有效光激活深部皮层组织，体内不损害神经元响应，引起组织损伤可比或少于广泛使用FDA批准UEA。未来研究应聚焦UOA植入长期效应（可能不同于急性响应）及设备取出潜在损伤。需探索减少摩擦和炎症响应的涂层或材料，实现更安全植入。

5 实验部分

实验设计

每实验在麻醉猕猴一侧半球皮层急性植入4-6“被动”UOA（无集成μLED）。插入完成后，动物处死并灌注固定剂。脑组织处理用于组织学和免疫组化，识别炎症和神经元死亡标志物，免疫组化标志物定量分析。

动物

三只成年雌性食蟹猴（Macaca fascicularis）用于本研究。所有程序遵循NIH实验室动物护理和使用指南，经犹他大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

外科程序

UOA植入在最后一天无关终端电生理记录实验进行。动物置立体定位仪，持续输注舒芬太尼（5-10 μg kg^-1 h^-1）维持麻醉。人工通气100%氧气，生命体征连续监测。IV输液3 cc kg^-1 h^-1。头皮切口后，大开颅和硬脑膜切开，涵盖所有视觉皮层及部分听觉、运动和体感皮层，允许4-6设备植入。UOA定位皮层上，然后由神经外科医生使用高速气动锤插入。插入完成后，动物用Beuthanasia（0.22 mL kg^-1, i.p.）处死，经心灌注盐水2-3分钟，随后4%多聚甲醛（PFA）0.1 M磷酸缓冲液20-25分钟。

UOA插入

共植入16个10×10被动UOA，3动物各半球5-6个。插入使用气动锤。插入UOA参数不同，包括针直径、表面纹理和尖端几何形状。针长1.3-1.7 mm。插入参数变化，主要脉冲压力，脉冲宽相对恒定（拨号设30或50 a.u.）。压力和脉冲设置首先通过测试对手指校准，确保设备接合导致插入锤单次打击。为清洁传递UOA入皮层无锤/UOA界面表面张力回拉，无菌盐水滴放薄骨膜起子上，起子轻靠UOA背板，然后插入锤打击。为最小化UOA背板过压组织损伤，本实验使用1 mm垫片，实现部分插入UOA，所有针长>1 mm。

组织学和免疫组化

灌注后，脑仔细从颅骨提取。UOA从皮层取出并检查。脑新鲜固定剂（4% PFA）后固定2天。各UOA植入皮层位点从脑其余部分阻断，各单独块对半切以利清晰显示光极针（如图2B）。切片前，各块蔗糖阶梯梯度（15%、20%和30%）平衡冷冻保护。各块-25°C Tissue-Tek冷冻，冠状切片20μm厚度用冷冻切片机（HM505E, Microm）。组织切片裱载玻片，-80°C存储直至免疫组化标记。

免疫组化，组织切片首先平衡室温（RT）以利最佳粘附显微镜载玻片。切片随后PBS（pH 7.4）洗三次10分钟，孵育牛血清白蛋白（BSA, 10%, Sigma; Millipore CAS#9048-46-8）PBS含0.5% Triton-X（PBS-T）（Sigma）1小时RT，随后孵育24小时4°C一抗稀释2% BSA + 0.5% PBS。用于染色星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞的一抗分别为：鸡多抗抗GFAP（1:200; Ab5541 Millipore; RRID:AB_177521）、兔多抗抗NeuN（1:200; AbN78 Millipore; RRID:AB_10807945）和兔多抗抗Iba1（1:100; Ab178846, Abcam; RRID:AB_2636859）。切片随后洗涤，孵育16小时Alexa-555和Alexa-488结合二抗（1:100, A-21437和A-21206, Invitrogen; RRID:AB_2535858和AB_2535792）。最后，切片Hoechst（1:200; Millipore, CAS# 875756-97-1）复染。

图像采集和分析

对各UOA插入区域，选择含最多针和全针长切片。这些切片双免疫染色GFAP和NeuN或GFAP和Iba1，Hoechst复染。高分辨率荧光图像这些免疫染色切片获取用Axio Observer Z1倒置显微镜（Carl Zeiss）10x物镜。单个图像拼接用Zen I软件（Carl Zeiss）获UOA插入区域完整宽场图像。对各UOA插入区域，分析一全切片每通道（3通道，每免疫组化标志物），特别含最多针切片，用ImageJ-FIJI 1.53f51软件（NIH）。图像转换二进制黑白图像通过ImageJ阈值算法，阈值稍手动调整以紧密匹配原免疫组化图像。阈值化分离感兴趣区域（ROI）内像素为含信号（设强度值255，白）和属背景（设值0，黑）。这些二进制图像上然后计算积分密度200×200 μm窗口内定位4不同皮层深度（对应皮层层图4、6和8A）沿各针留下针道一边。窗口大小有效覆盖针间组织全宽。积分密度定义为测量窗口内白像素数和最大像素强度值（255）乘积，称相对荧光单位（RFUs）。此法有效测量测量窗口内白像素数。对照，各切片类似测量积分密度非植入组织定位至少离UOA插入区域500μm（如图3、5和7）。这些对照测量用于归一化积分密度度量显示图4、6和8。

统计

统计分析进行用GraphPad Prism 8.0.1软件（San Diego, CA）。数据集评估正态性用Shapiro-Wilk检验（n<50）。参数检验，包括t检验、Pearson相关和单因素ANOVA，数据展正态分布时使用。正态假设违反时，非参数检验使用，包括Mann-Whitney检验、Kruskal-Wallis检验和/或Spearman相关。数据展示均值±标准误（s.e.m.），p值<0.05认为统计显著。