多酚介导的结晶中间相脂质纳米粒工程：构建多功能载药新平台

　　本综述系统介绍了利用多酚（如单宁酸TA）调控脂质自组装行为，构建具有立方相（Im3m）等非层状结晶中间相的脂质纳米粒（LNPs）的创新策略。通过分子动力学模拟与实验验证，揭示了多酚浓度依赖性的介导机制，突破了传统脂质纳米载体对特定相形成脂质的依赖。该平台可高效负载金属离子、小分子药物、蛋白质及mRNA等多种 cargo，为药物递送系统提供了结构可调、稳定性强的新型设计范式。

　　

引言

脂质不仅是细胞膜的结构基础，更是参与细胞内信号传导、能量储存和分子识别等关键生物学过程的重要生物分子。其固有的自组装特性使其能够形成多种液晶中间相，包括层状（lamellar）和非层状（如立方相和六方相）结构。这种结构多样性主要由临界堆积参数（CPP）决定，该参数将分子形状与界面曲率相关联。脂质纳米载体（如脂质体）在药物递送领域应用广泛，例如美国FDA批准的首个阿霉素脂质体制剂Doxil，以及用于RNA递送的Onpattro和mRNA新冠疫苗（BNT162b2和mRNA-1273）。与传统脂质体相比，非层状液晶脂质纳米粒（LC-LNPs）因其内部弯曲有序的纳米结构而具有更高的比表面积，能够更高效地封装亲水或疏水分子。然而，现有LC-LNPs的构建策略主要依赖于有限种类的固有形成非层状中间相的脂质（如单油酸甘油酯MO和植烷三醇PHY），或需要精确分子设计的合成两亲分子，这极大地限制了其设计空间和结构多样性。此外，温度、储存时间和客体分子存在等多种因素会影响非层状中间相的稳定性和结构完整性，制约了其规模化生产和广泛应用。

多酚介导的LC-LNPs组装

通过微流控装置将多酚（如单宁酸TA的水溶液）与脂质（如溶解于乙醇中的1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG））混合，可一步自组装形成具有Im3m微米级立方中间相的LC-LNPs。该中间相的形成严格依赖于TA与DMG-PEG的摩尔比。当TA缺失时，DMG-PEG脂质（2 mM）自组装形成无有序纳米结构的I型胶束，这与既往研究中PEG化脂质因高正曲率而形成胶束的结论一致。当TA与DMG-PEG摩尔比为0.33:1时，纳米粒的小角X射线散射（SAXS）图谱中出现宽峰，表明出现了无序的微米级立方相，这归因于TA与DMG-PEG胶束结合并降低了其脂质界面正曲率。当TA与DMG-PEG摩尔比达到或超过1:1时，形成了单分散的Im3m微米立方体（以下简称立方体），其SAXS图谱中显示出√2:√4:√6的间距比。使用更高浓度DMG-PEG（10 mM）制备纳米粒时，中间相转变随多酚与脂质比例的变化趋势类似。TA/DMG-PEG立方体的尺寸（90-260 nm）可通过多酚和脂质的浓度进行调节。随着TA与DMG-PEG摩尔比从0:1增加至10:1，纳米粒的ζ电位从-4 mV降至-30 mV，表明TA存在于立方体表面。核磁共振氢谱（¹H NMR）显示，增加TA比例会导致立方体中TA占比升高。该立方体在Tween 20中解离，但在NaCl和尿素溶液中保持稳定，表明纳米粒组装的主要驱动力是疏水相互作用。与常规配方（如MO和PHY）制备的立方体稳定性差不同，本文制备的TA/DMG-PEG立方体在室温或4°C的水环境中可稳定储存至少一年，且尺寸和结构无变化。

PLC-LNPs组装的分子洞察

采用分子动力学（MD）模拟揭示了多酚和脂质组分在实验观察到的微米立方体系统形成中的作用。构建全原子模型以探索TA/脂质混合物在水中的自发关联，并研究所得超分子组装体受以下因素的影响：i) TA:脂质比例，ii) 水合程度，或 iii) PEG链长。模拟结果表明，较高的TA浓度导致脂质中间相从层状双层转变为DMG-PEG400系统中的胶束。模拟的三维网络浓度分布显示，DMG-PEG提供了TA与水之间的界面边界。与实验一致的网络组成（TA与DMG-PEG摩尔比为2.7:1）的全原子结构突出了实验观察到的立方周期网络。两亲性DMG-PEG通过亲水区PEG与水和TA介质结合，并通过疏水区DMG形成脂质胶束，从而 enabled 这些界面微米立方系统的形成，密度分布和组分官能团之间的特异性相互作用证明了这一点。与传统两亲系统类似，TA和DMG-PEG形成的PLC-LNPs由脂质尾部内的疏水相互作用通过界面能最小化驱动，模拟的全原子结构和实验解离 assay 均证实了这一点。亲水相互作用，即PEG、TA和水之间的氢键，是该微米立方结构亲水区域中存在的主要相互作用。该界面系统内所有分子组分的结构和流动性以及水分子的流动性均有展示。被捕获在持久位置的水分子主要位于TA支架内，而在通道内移动的动态水分子主要位于PEG区域。

PLC-LNPs的组成工程

MD模拟揭示，PLC-LNPs的纳米结构受多酚与脂质之间相互作用的影响，通过改变组装构建块来调节纳米结构成为可能。定制脂质-多酚组装体的纳米结构和组成对于调整其生物物理特性（如膜曲率和表面拓扑结构）至关重要，这些特性 consequently 决定了细胞摄取机制和递送结果。此外，不同的内部中间相具有不同的晶体学对称性和扩散特性，使得能够合理调节 cargo 转运和控制药物释放。将DMG-PEG更换为其他类型的PEG缀合双十四烷基脂质——即2-(聚乙二醇-2000)-N,N-双十四烷基乙酰胺（ALC-0159）和α-(3′-{[1,2-二(肉豆蔻氧基)丙氧基]羰基氨基}丙基)-ω-甲氧基聚氧乙烯（PEG-c-DMG）——在与TA以1.8:1的摩尔比混合后，形成了具有不同晶格参数（分别为108和122 ?）的Im3m微米立方体。使用不同的脂质，即二油酰磷脂（1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC））在与TA以1.8:1的摩尔比混合后，形成了具有多层纳米结构的脂质体。这种转变与先前的一项研究一致，该研究将磷脂的多层性归因于TA与磷酸胆碱头基之间的多个氢键相互作用，从而促进了膜间粘附和堆叠。将TA与PEG缀合的二油酰磷脂（1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000)]（DOPE-PEG））以相同的TA与脂质比例混合，产生了具有松散堆积胶束结构的纳米粒。这些转变可能是由于TA调节长碳链脂质界面曲率的能力有限。

引入金属离子（Zn²⁺、Fe³⁺或Zr⁴⁺）作为第三组分导致在PLC-LNPs中形成金属-酚网络（MPN），这对基于DMG-PEG、ALC-0159和PEG-c-DMG的立方体的中间相或晶格参数影响可忽略不计。然而，在将Fe³⁺引入系统后，基于DOPC和DOPE-PEG的PLC-LNPs中观察到从层状到反六方相，以及从无序中间相到I型微米立方体的结构变化。尽管TA–Fe³⁺/DOPC NPs的SAXS峰不足以进行明确的相鉴定，但这些NPs显示出明确定义的晶格条纹，具有六方中间相的特征，与TA/DOPC脂质体中观察到的同心多层形态形成对比。这可能是由于TA-Fe³⁺复合物通过亲水区域形成的MPN比游离TA更有效地调节二油酰脂质的相变。多酚已被证明与磷脂形成氢键并诱导脂质弯曲。此外，据报道金属离子与磷脂配位，这可能促进磷脂基组装体中更负的曲率。不同脂质类型之间的相行为差异可以使用CPP值定性理解。DMG-PEG具有短饱和尾部和PEG2000头基，其CPP值小（<1/3），有利于高曲率胶束组装。其正曲率可以通过与TA的相互作用降低，从而形成微米立方体。DOPC的CPP接近1，自然形成层状双层。在TA/DOPC和TA-Fe³⁺/DOPC NPs之间观察到的层状到六方相的转变可能反映了由MPN形成引起的界面曲率应力的增加，这扰乱了脂质双层的原始堆积。相比之下，DOPE-PEG5000具有大的PEG头基和长的C18酰基链，表现出非常小的CPP值和PEG5000冠层施加的高界面约束。这种不利的堆积可能解释了TA/DOPE-PEG颗粒中松散堆积的胶束结构，而MPN的形成引入了足够的界面调节，通过降低DOPE-PEG胶束的正曲率，在TA–Fe³⁺/DOPE-PEG颗粒中诱导出有序的微米立方相。

尽管MPN组成的变化，包括多酚（TA和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG））、金属离子（Zn²⁺、Fe³⁺和Zr⁴⁺）以及多酚与金属离子之间的摩尔比（从200:1到1:1）不影响基于DMG-PEG的立方体的纳米结构，但金属离子的掺入增强了立方体在酸性条件下的稳定性。这种增加的稳定性可能归因于减少的MPN配位和质子化TA（pK_a ≈ 6）在酸性条件下增强的π-π相互作用的平衡效应。

cargo 封装入PLC-LNPs

LC-LNPs可以封装亲水和疏水 cargo。为了证明其疏水 cargo 负载能力，将1,1′-双十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐（DiD）脂质染料和胆固醇分别加载到TA/DMG-PEG立方体中。比较TA/DOPC脂质体和TA/DMG-PEG立方体的DiD负载效率，以评估立方中间相的功能优势。TA/DOPC脂质体在高DiD剂量（2%）下显示出有限的DiD封装效率（约10%），而TA/DMG-PEG立方体在高和低DiD摩尔百分比（0.2%和2%）下均保持高的DiD封装效率（>95%），表明立方体系统具有增强的疏水 cargo 负载能力。对这些DiD标记的NPs的细胞内共定位分析进一步揭示，与TA/DOPC脂质体相比，TA/DMG-PEG立方体在MDA-MB-231细胞中显示出更高的内体逃逸效率，这可能归因于立方中间相的独特结构特征。将10%胆固醇加入脂质相使立方体的晶格参数从117.3 ?增加到122.3 ?，表明胆固醇嵌入脂质基质中。当胆固醇百分比增加到30%时，立方相有序度降低，晶格参数增加到134.7 ?，这可能是由于过量的胆固醇扰乱了维持Im3m对称性所需的精细曲率平衡和堆积几何。

多酚通过配位、氢键、π相互作用、疏水相互作用和静电相互作用与多种分子显示多种相互作用。因此，我们也评估了PLC-LNPs将亲水 cargo 加载到立方体基质亲水区域的能力。小分子抗癌药物DOX通过后加载策略以高达94%的负载效率加载到EGCG-Fe³⁺/DMG-PEG立方体中。高DOX负载归因于立方体基质内连续亲水区域的存在，以及DOX通过疏水相互作用和 respectively 配位对多酚和金属离子的亲和力。加载DOX后立方体尺寸变化极小。此外，负载DOX的EGCG-Fe³⁺/DMG-PEG立方体（DOX@EGCG-Fe³⁺/DMG-PEG立方体）对乳腺癌细胞（MDA-MB-468和MDA-MB-231）显示出与游离DOX相当的细胞毒性，而未加载DOX的立方体表现出可忽略的细胞毒性。

多种类型的生物分子——包括多肽（如聚-L-精氨酸（PLA））、蛋白质（如辣根过氧化物酶（HRP））、多糖（如壳聚糖）、核酸（如mCherry mRNA）——已被报道与多酚表现出 distinct 相互作用，并成功掺入立方体而不破坏立方纳米结构。与TA/DOPC脂质体相比，TA/DMG-PEG立方体表现出更高的PLA封装效率，这可能是由于其独特的内部纳米结构更有效地容纳大分子 cargo。改变TA与PLA或壳聚糖的比例影响 cargo 负载效率，以及组装的立方体的尺寸，其可调范围在146至423 nm之间。此外，负载PLA和壳聚糖的TA基立方体（PLA@TA/DMG-PEG和壳聚糖@TA/DMG-PEG立方体）表现出表面电荷反转特性，从负电或中性（pH 7时）变为正电（pH 4时）。TA/DMG-PEG立方体还能够负载HRP且尺寸变化可忽略。负载HRP的TA基立方体（HRP@TA/DMG-PEG立方体）在存在H₂O₂的情况下对amplex red的氧化表现出与游离HRP相当的催化活性。

通过将EGCG-Zn²⁺/DMG-PEG立方体与分散在EGCG溶液中的mRNA孵育，实现了mRNA的后加载到立方体中。选择该配方是因为Zn²⁺可以与mRNA的磷酸骨架配位，这有望增强mRNA负载效率。此外，在后加载过程中添加EGCG增强了mRNA负载效率，这可能是由于EGCG通过氢键与mRNA的磷酸骨架相互作用。加载mRNA后立方体尺寸变化可忽略，并且负载mRNA的立方体（mRNA@EGCG-Zn²⁺/DMG-PEG立方体）显示出约75%的转染效率且细胞毒性可忽略。mRNA在模拟细胞溶质的还原性缓冲液（10 mM谷胱甘肽（GSH））中从立方体中释放更快（3小时内约80%），而在水（24小时内<10%）或细胞培养基（24小时约30%）中则较慢。这种GSH响应行为归因于GSH通过配位和非共价相互作用分别对Zn²⁺和EGCG的高亲和力，导致立方体基质部分解离。

结论

本研究揭示了天然多酚可以调节脂质中间相，并且多酚/脂质系统可以组装成具有有序Im3m微米级立方纳米结构的NPs，其中脂质胶束通过多酚支架闭堆积。该系统的纳米结构受多酚和脂质之间的相互作用控制，并可通过改变组装构建块进行调节。多酚/脂质纳米结构系统凭借多酚的粘附特性和疏水脂质核心的存在，允许加载多种 cargo，用于 diverse 潜在应用。纳米结构NPs的相行为和物理化学性质的调节通常通过合成新的两亲分子或不同两亲分子之间的相互作用来实现。相比之下，我们的工作表明，有序纳米结构的形成也可以通过两亲分子和多酚之间的相互作用来实现。此外，纳米结构NPs的物理化学性质（例如pH稳定性）可以通过掺入不同的客体分子来调节。这项工作为设计和组装用于 diverse 应用的纳米结构功能化LNPs提供了一个平台。