革兰氏阴性菌通过H2S和铁载体协同防御系统获得活性氧抗性的机制研究及其临床意义

　　本研究发现革兰氏阴性菌（包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌）在反复暴露于活性氧（ROS）后能发展出显著抗性，其最小抑菌浓度（MIC）最高提升256倍。抗性机制主要涉及三重协同防御屏障：增强的硫化氢（H2S）生物合成、铁载体（如pyoverdine, PVD）的抗氧化作用及其介导的铁离子（Fe3+）转运功能，以及外膜（OM）屏障的强化。研究进一步揭示通过补充Fe3+或敲除H2S合成基因（如cse）可显著逆转该抗性，为针对耐药革兰氏阴性菌的新型抗菌策略提供了关键靶点。

　　

1 引言

全球公共卫生正面临细菌对抗生素产生耐药性的严峻危机，亟需探索替代策略以应对感染问题。活性氧（ROS）作为具有强抗菌活性的活性分子，通过诱导氧化应激损伤细菌的DNA、蛋白质和脂质等大分子，最终导致细菌死亡。随着抗生素耐药性威胁的日益加剧，ROS可能成为传统抗生素的替代或辅助手段，用于根除包括多重耐药菌株在内的细菌。然而，与抗生素和银的耐药性类似，细菌是否会对ROS产生适应性抵抗仍是一个未被充分探讨的问题。值得注意的是，革兰氏阴性菌已表现出对银的耐药性，但针对ROS攻击的细菌耐药性发展却鲜有研究。

本研究旨在探究细菌是否能够发展出对ROS的耐药性。通过实验进化方法，我们在多次亚抑菌浓度ROS暴露下培养了革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，以确定不同细菌类型中是否演化出独特的ROS耐药机制。观察结果显示，革兰氏阴性菌在进化过程中迅速获得对ROS的耐药性，而革兰氏阳性菌的相对耐药性发展较为有限。进一步分析揭示了革兰氏阴性菌中一种新型的三重协同防御屏障，由硫化氢（H₂S）、铁载体（pyoverdine）和外膜屏障组成。这些发现不仅阐明了ROS耐药性的机制，还为通过先进技术克服该耐药性提供了策略。

2 结果

2.1 细菌对ROS攻击的耐药性发展

本研究采用最普遍易得的ROS——过氧化氢（H₂O₂）来诱导耐药性，并通过最小抑菌浓度（MIC）测定进行评估。经过十次连续的细菌培养阶段，发现在第六次传代后，铜绿假单胞菌（PAO1）对H₂O₂的MIC增加了八倍，表明出现了H₂O₂耐药性。尤为显著的是，经过十次传代后，菌株的MIC增加了256倍（从18.3 μg mL^?1增至4688 μg mL^?1），说明铜绿假单胞菌PAO1极易发展出ROS耐药性。同样地，大肠杆菌（K-12）和肺炎克雷伯菌（ATCC10031）在经过十次重复传代后也发展出对H₂O₂的耐药性。这些结果明确显示，所有研究的革兰氏阴性菌株在经过反复暴露后均发展出对H₂O₂的耐药性，其MIC值显著高于敏感的祖先菌株。

2.2 H₂S生物合成介导的防御系统

MIC的显著增加表明，铜绿假单胞菌PAO1相比其他革兰氏阴性菌株更容易发展出ROS耐药性。通过RNA测序技术，我们深入探索了ROS耐药性背后的机制。首先，基于皮尔逊相关系数计算构建了野生型（WT，P1）和第十代（P10）菌株之间的热图，所有计算得到的相关系数均处于可接受范围（|r| > 0.6）。随后，利用京都基因与基因组百科全书（KEGG）进行功能分析，发现P10 ROS耐药菌中甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢增强。进一步分析显示，胱硫醚γ-裂解酶（CSE）和胱硫醚β-合酶（CBS）参与了该代谢过程，相应的cse和cbs基因在P10菌株中显著上调。

CSE和CBS在细菌中的另一个关键作用是催化底物半胱氨酸产生硫化氢（H₂S），从而保护细菌免受抗生素诱导的氧化应激。实验结果显示，P10菌株中半胱氨酸代谢显著增强，主要受cse和cbs基因调控。因此，我们假设cse和cbs的上调促进了P10菌株中H₂S的产生，进而保护细菌免受ROS诱导的氧化应激，并促使细菌发展出对ROS的耐药性。

为了检测H₂S的产生，我们首先采用了经典的醋酸铅反应试验，结果显示P10 ROS耐药菌在培养24小时后产生了更大量的H₂S。通过H₂S荧光探针（WSP5）的进一步分析也证实了P10菌株中H₂S产生的显著增强。在此基础上，我们通过向ROS敏感的WT菌株悬浮液中人工添加H₂S供体NaHS，显著提高了其对H₂O₂的耐药性，MIC增加了64倍。然而，这一增幅仍远低于P10菌株的256倍。另一方面，CSE被认为是H₂S的主要生成酶，通过敲除P10菌株中的cse基因，MIC的增加从256倍降至16倍。尽管耐药性有所降低，P10 Δcse菌株仍保留了一定的ROS耐药性，这表明菌株内存在其他辅助性耐药机制。

2.3 铁载体的生物合成及其介导的协同ROS耐药性

为了进一步探索潜在的ROS耐药机制，我们对RNA测序结果进行了基因本体（GO）富集分析。结果显示，P10 ROS耐药菌中pyoverdine（PVD）的代谢和生物合成过程显著增强。通过GO功能显著性富集分析，我们发现PVD和铁载体的代谢受多个共同基因调控，这是由于PVD作为一种铁载体，能够螯合铁离子。此外，负责PVD及其前体生物合成的调控基因均出现上调，同时参与PVD运输及其最终铁离子捕获的调控基因也显著表达。

一般而言，PVD的生物合成起始于细胞质，结束于周质，最终被分泌到细胞外空间。PVD作为一种群体感应分子，在KEGG富集分析中显示其群体感应通路显著增强。位于pvd基因座的基因编码多种酶（如PvdH、PvdL、PvdF、PvdA、PvdJ和PvdD），调控细胞质中PVD前体的生物合成，这些前体随后通过PvdE ATP结合盒（ABC）转运蛋白跨内膜（IM）运输到周质。最终，PVD在周质中的生物合成由PvdN、PvdP、PvdQ和PvdO等酶调控，并通过外排泵PvdRT-OpmQ释放到细胞外空间。在螯合细胞外Fe³⁺后，细菌将PVD-Fe³⁺复合物内化以摄取铁离子。该复合物被FpvA与TonB及其伙伴ExbB和ExbD识别，然后通过泵运输穿过外膜（OM）到达周质，在周质中酶FpvC和FpvF催化分离。分离的Fe³⁺在周质中被还原为Fe²⁺并运输到细胞质，而分离的PVD则被回收回到细胞外空间。

总体而言，PVD的酚羟基结构赋予其强大的抗氧化能力，其在细胞外空间的广泛分布可以保护细菌免受微环境中的ROS损伤，从而逐步发展出ROS耐药性。更重要的是，细胞外空间中的氧化性Fe³⁺可能与H₂S反应并消耗H₂S，导致可用于清除ROS的H₂S减少，这对细菌的保护是不利的。然而，在P10 ROS耐药菌中，增强的PVD生物合成促进了大量Fe³⁺从细胞外空间向细菌内的运输，导致细胞外空间中可用于消耗H₂S的Fe³⁺显著减少，从而使得更多的H₂S可用于清除ROS，有利于细菌ROS耐药性的发展。

此外，另一种铁载体pyochelin（PCH）的生物合成及其对Fe³⁺的摄取在P10 ROS耐药菌中也显著增强，这进一步降低了细胞外Fe³⁺水平，从而增强了P10菌株的抗氧化能力。值得注意的是，PVD和PCH铁载体均是铜绿假单胞菌特有的代谢产物，表明该菌具有一种特殊的、依赖铁载体介导的防御机制来对抗ROS。因此，与其他革兰氏阴性菌相比，铜绿假单胞菌表现出更高的ROS耐药性发展倾向。同时，我们还观察到一种吩嗪抗生素的生物合成显著增强，这一现象可归因于大量Fe³⁺被转运到菌体内，导致在铁缺乏的培养基中合成大量吩嗪，进而促进细菌的铁代谢。

2.4 外膜屏障对ROS的防御及其他潜在ROS耐药通路

通过对上调基因进行GO注释分析，我们研究了它们在生物过程、细胞组分和分子功能中的参与情况。结果显示，与铁载体和H₂S生物合成过程相关的跨膜运输、pyoverdine生物合成过程、ABC转运体复合物、细胞外区域、氧化还原酶活性和金属离子结合均显著增强，这进一步证实了铁载体和H₂S产生在协同防御ROS中的作用。此外，在表达增加的细胞组分中，我们意外发现主要上调的基因主要富集在质膜和膜的整体成分中。同时，调控膜整体成分和外膜生物合成的基因也显著上调。

我们注意到bamA基因显著增强，该基因编码BamA蛋白。BamA蛋白是β-桶装配机器（BAM）复合物的核心组件，通过该复合物，外膜蛋白（OMPs）被捕获、插入并折叠到OM上。因此，bamA基因的显著上调导致更多OMPs插入和折叠到OM上，形成了一层致密而坚固的OM屏障，阻止ROS渗透到细菌内部，从而进一步保护细菌免受氧化应激损伤。通过扫描电子显微镜（SEM）观察，WT（P1）ROS敏感菌株和P10 ROS耐药菌株在形态上没有显著差异。然而，通过生物透射电子显微镜观察细菌膜的横截面结构，发现P10 ROS耐药菌的膜明显更致密、更坚固，这进一步证实了BamA蛋白介导的OM调控所诱导的ROS耐药性。

我们还注意到酪氨酸的代谢和分解代谢过程增强，酪氨酸是一种芳香族氨基酸。酪氨酸代谢的一个关键途径是在酪氨酸氨基转移酶的催化下转化为尿黑酸，而编码芳香族氨基酸氨基转移酶的基因phhc也显著上调。因此，我们推断酪氨酸在芳香族氨基酸氨基转移酶催化下大量产生尿黑酸，其酚羟基结构赋予其强大的抗氧化能力，从而有助于清除ROS。最后，与生物膜生物合成和形成相关的调控基因也显著上调。KEGG富集分析显示，铜绿假单胞菌生物膜的形成显著增强，这是由强化了的群体感应调控所控制的。通过结晶紫染色评估不同菌株的生物膜形成能力，发现培养48小时后，P10菌株显示出更密集的结晶紫沉积和更高的590 nm吸光度，表明其生物膜形成能力增强。

然而，适应性耐药通常伴随着适应性代价。我们对菌株的生长动力学进行了表征，发现P10菌株的浮游生长速率降低，这可能归因于能量资源被重新分配给生物膜发育。与这一表型一致的是，P10菌株中relA基因显著上调，该基因调控细菌的严紧反应，赋予对ROS的耐受性，同时抑制核糖体生物合成，从而减缓生长。此外，P10菌株中phz操纵子显著上调，该操纵子编码铜绿假单胞菌生物膜形成中涉及的绿脓菌素毒力因子。生物膜的保护作用进一步增加了细菌对ROS攻击的耐受性。

为了进一步验证P10菌株对ROS的解毒能力，我们首先使用DCFH-DA评估了其对一般ROS的耐受性。荧光强度直接反映了细胞内氧化应激水平，实验结果显示，经过ROS处理后，P10 ROS耐药菌株的荧光强度显著弱于WT（P1）ROS敏感菌，表明P10菌株具有更优异的抗氧化能力。为了确认P10 ROS耐药菌株对其他ROS也表现出耐药性，我们采用更强大的单线态氧（¹O_{2）和羟基自由基（?OH）处理细菌。当P10菌株与1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）混合并经过¹O2生成光敏剂二氢卟酚e6处理时，其吸光度（OD值）下降幅度最大，表明P10对¹O2的清除能力增强。定量分析显示，P10菌株的¹O2清除率达到41.24%。随后，将P10菌株与?OH生成系统（FeSO4-H2O2）混合10分钟后，检测到最低的?OH特征峰强度。这些结果共同表明，P10菌株对ROS具有强大的解毒能力。此外，¹O2和?OH在10分钟内可消除95%以上的WT（P1）ROS敏感菌，而仅消除约40%的P10 ROS耐药菌，进一步证明了P10菌株对ROS的耐受性增强。}

有趣的是，在革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（USA300）的平行实验中，ROS的MIC仅出现轻微且可忽略的波动，表明在相同处理条件下，未出现明显的金黄色葡萄球菌对ROS的耐药性。因此，诱导的细菌对ROS的耐药性似乎仅限于革兰氏阴性菌株。

2.5 ROS耐药性的调控

为了进一步验证铁载体诱导的ROS耐药性及其与H₂S介导的防御屏障的协作，我们首先将铁螯合剂加入到ROS敏感的WT（P1）菌株悬浮液中以去除培养基中的Fe³⁺，导致H₂O₂的MIC增加了64倍。此外，在同时加入铁螯合剂和H₂S供体NaHS后，细菌对ROS的耐药性进一步增强。相反，向P10 ROS耐药菌的培养介质中引入适量的Fe³⁺后，其耐药性显著降低，而在补充了Fe³⁺的cse基因敲除菌株培养物中，这种耐药性的降低更为显著。这些发现表明，增强的铁载体代谢保护细菌免受ROS诱导的损伤，并且由铁载体代谢和H₂S生物合成协同作用建立的强大防御系统对细菌的ROS耐药性至关重要。随后，我们夸张地向金黄色葡萄球菌USA300悬浮液中引入H₂S供体NaHS，其对H₂O₂的耐药性显著增加了32倍，这进一步证实了H₂S生物合成是细菌发展ROS耐药性的基本机制之一。

3 讨论

本研究的结果揭示，革兰氏阴性菌在反复暴露于亚抑菌浓度的ROS后表现出明显的耐药反应，而革兰氏阳性菌的相对耐药性较弱。这种耐药性主要由三重协同屏障触发。在革兰氏阴性菌中，cse和cbs基因的上调通过半胱氨酸代谢介导了H₂S产量的增加，其强大的还原性质有助于清除ROS并缓解细菌的氧化应激。此外，革兰氏阴性菌中增强的铁载体代谢，由一系列上调的pvd基因调控，导致细胞外PVD铁载体水平显著增加。PVD的酚羟基结构赋予其强大的抗氧化特性，使其能够清除细胞外的ROS。同时，PVD螯合细胞外Fe³⁺并将其运输到周质，从而降低细胞外Fe³⁺水平，限制其参与H₂S反应，使得更多的H₂S可用于清除ROS。由BamA蛋白为核心的BAM复合物介导的OMPs在OM上的折叠增强，进一步促进了更坚固、致密和紧凑的细菌细胞膜的形成，这进而增强了对ROS渗透和后续损伤的抵抗能力。由于革兰氏阴性菌独特的外膜结构，它们相比革兰氏阳性菌更容易发展出对ROS的耐药性。

最近的一项研究中，Galdino等人意外发现， ancestral敏感的铜绿假单胞菌菌株能够通过产生铁载体pyoverdine在高浓度的头孢菌素cefiderocol下存活。Cefiderocol在治疗危重医院或囊性纤维化患者的碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌感染方面特别有效，这些患者治疗选择有限。不幸的是，cefiderocol的耐药性在临床分离株中也有报道。Pyoverdine能够从cefiderocol中螯合铁，从而降低其对抗铜绿假单胞菌的效力。这些发现进一步证明，铁载体可以通过增强铁螯合作用发挥意想不到的保护性协作作用。

必须指出的是，尽管在革兰氏阳性菌中未观察到耐药性，但不能排除在较长时间（例如超过十次传代）内进化出耐药性的可能性。因此，需要深入探索这些潜在情况。此外，我们认识到进化适应的不可预测性可能导致不同的表型或涉及不同的基因，从而产生多种机制和耐药水平。因此，研究和理解不同人群中出现的多种ROS耐药机制的影响至关重要。未来的研究涉及多个种群可能会揭示进一步的ROS耐药策略。此外，暴露浓度、持续时间以及其他应激源的存在等因素也将影响耐药性的发展。

值得注意的是，通过向培养基中引入额外的Fe³⁺离子或敲除H₂S代谢基因cse，可以显著降低已发展的ROS耐药性。这些发现突出了可能导致细菌对抗菌剂产生耐药性的基本机制，并可进一步用于确定开发创新抗菌策略的关键靶点。此外，我们的研究结果建议避免广泛使用ROS作为杀菌剂（包括光动力疗法、声动力疗法、冷等离子体和免疫激活）治疗革兰氏阴性菌，以免加剧全球耐药性问题。采取这种谨慎策略可能有助于推迟甚至避免未来ROS耐药超级细菌的出现，这些超级细菌将对人类健康和福祉构成更大威胁。

4 结论

总之，我们的研究表明，革兰氏阴性菌在长期和反复暴露后能够迅速获得对ROS抗菌特性的耐药性。这种耐药性主要由H₂S和PVD铁载体介导的协同防御屏障触发。一方面，H₂S的强大还原特性和PVD中酚羟基结构的抗氧化能力有助于中和ROS，从而减轻氧化应激和ROS对革兰氏阴性菌的抗菌活性。另一方面，培养基中存在的氧化性Fe³⁺离子会螯合H₂S，这削弱了H₂S在清除ROS方面的有效性。然而，PVD将大量Fe³⁺运输到细菌内部，重新激活了被Fe³⁺螯合的H₂S用于ROS清除，并有助于革兰氏阴性菌逐步发展出ROS耐药性。BamA蛋白介导的OM屏障进一步阻碍了ROS渗透到细菌内部，从而保护革兰氏阴性菌免受ROS诱导的损伤。重要的是，这种发展的ROS耐药性可以通过向培养基中引入额外的Fe³⁺离子或敲除H₂S代谢基因cse来显著抑制。这些发现阐明了可能导致细菌对抗菌剂产生耐药性的关键机制，并可进一步用于开发创新抗菌方法的重要靶点。此外，我们的结果建议研究人员在使用ROS作为杀菌剂治疗革兰氏阴性菌时保持谨慎，因为这可能有助于推迟甚至预防未来ROS耐药超级细菌的出现，这些超级细菌将对人类健康和福祉构成日益严重的威胁。

5 实验部分

化学品

除非另有说明，所有化学品均采购自Sigma–Aldrich（美国）。碱性醋酸铅、1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）、5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）、FeSO₄和二氢卟酚e6购自阿拉丁试剂有限公司（中国上海）。WSP5购自GlpBio（美国）。

菌株和培养

野生型铜绿假单胞菌（PAO1）、大肠杆菌（K-12）、肺炎克雷伯菌（ATCC10031）和金黄色葡萄球菌（USA300）菌株购自北京贝纳文化收藏有限公司（中国北京）。铜绿假单胞菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌株在Luria–Bertani（LB）培养基中于37°C培养，而肺炎克雷伯菌菌株在营养肉汤（NB）中于37°C培养过夜。经过夜培养后，将菌株重新接种到新鲜培养基中，并使其增殖直到达到指数期。随后，使用相应肉汤进行1000倍稀释，得到约10⁶菌落形成单位（CFU）每毫升用于进一步研究。每代微生物的储备溶液在相应肉汤中配制，添加25%甘油，并储存于-80°C。

量化对ROS的耐药性

ROS（以H₂O₂形式）的初始抗菌效果通过标准浮游最小抑菌浓度（MIC）测量进行评估。这些实验使用96孔板进行三次重复。将100 μL H₂O₂溶液在细菌肉汤中连续稀释，并接种100 μL不同细菌悬浮液（1 × 10⁶ CFU mL^?1），最终孔体积为200 μL。H₂O₂的最终测试浓度从15%开始，依次减半直至第二十三次稀释。混合物在37°C摇床培养箱中孵育24小时。

为了研究耐药性的进化，细菌反复暴露于ROS进行十次连续传代。制备野生型（WT）细菌亲本菌株，并用于接种一系列连续稀释的H₂O₂。MIC确定为24小时后抑制测试微生物可见生长的最低抗菌剂浓度。收集含有存活细菌的亚MIC培养物（MIC以下的前三个孔）并稀释10万倍。然后将20 μL稀释的细菌溶液在37°C的琼脂上亚培养24小时。取单个菌落用于接种制备，密度为1 × 10⁶ CFU mL^?1，用于下一次传代，其中细菌暴露于第二批新的稀释H₂O₂系列。整个过程与上述从初始接种到新接种制备的描述相同。该过程重复最多十次传代，记录每次传代的MIC。

MIC的增加倍数通过将感兴趣传代N的MIC除以WT敏感细菌的MIC来确定。

RNA测序分析

实验使用TruSeqTM Stranded Total RNA Library Prep Kit构建文库，在合成第二条cDNA链时，用dUTP代替dNTPs试剂中的dTTP，导致第二条cDNA链中包含A/U/C/G碱基。在PCR扩增之前，使用尿嘧啶-DNA糖基化酶（UNG）酶消化第二条cDNA链，确保文库仅包含第一条cDNA链。

1. 1.

   总RNA提取：从组织样品中提取总RNA，并使用Nanodrop2000评估提取的RNA的浓度和纯度。通过琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性，并使用Agilent 2100测量RNA完整性数（RIN）。每个文库构建需要总RNA量为2 μg，浓度≥100 ng μL^?1，OD260/280比率介于1.8和2.2之间。

2. 2.

   rRNA去除：与真核mRNA不同，原核mRNA在3′端没有polyA尾，因此无法通过与Oligo dT的A-T碱基配对从总RNA中分离mRNA。通常，rRNA去除用于转录组分析。

3. 3.

   mRNA片段化：Illumina平台对短片段进行测序，富集的mRNA由平均长度几千碱基的完整RNA序列组成。因此，mRNA必须随机片段化。添加片段化缓冲液允许将mRNA随机断裂成约200 bp的片段。

4. 4.

   通过逆转录合成cDNA：在逆转录酶的作用下，使用随机引物，以mRNA模板合成第一条cDNA链。在第二条链合成期间，dNTPs试剂中使用dUTP代替dTTP，导致第二条cDNA链中包含A/U/C/G碱基。

5. 5.

   适配器连接：双链cDNA结构具有粘性末端。添加末端修复混合物以平末端化，然后在3′端添加A碱基以促进Y形适配器的连接。

6. 6.

   用UNG酶消化第二条cDNA链：在PCR扩增之前，使用UNG酶消化第二条cDNA链，确保文库仅包含第一条cDNA链。

7. 7.

   Illumina HiSeq测序：1）文库富集和PCR扩增15个循环；2）使用TBS380（Picogreen）定量并根据数据比例混合样品进行测序；3）在cBot上进行桥式PCR扩增以生成簇；4）在Illumina HiSeq平台上进行测序，读取长度为2×150 bp / 300 bp。

H₂S检测

首先使用经典的醋酸铅反应试验检测H₂S的存在。将适量醋酸铅（II）溶解在蒸馏水中，制成浓度为2%的醋酸铅溶液用于测试。切取一片滤纸，浸泡在醋酸铅溶液中直至完全饱和。将滤纸小心从溶液中取出，并在远离任何H₂S源的通风区域晾干。随后，将干燥的滤纸放置在含有细菌悬浮液的12孔板表面，细菌在37°C孵育24小时。之后观察滤纸的颜色变化。最后将滤纸的颜色强度与标准进行比较。然后使用WSP5 H₂S亲核取代-环化荧光探针检测和定量生物系统中的H₂S。

基因敲除

从铜绿假单胞菌（PAO1）基因组中使用高