基于巴洛沙韦设计的首创型内切酶抑制剂LN-7：在细胞培养及小鼠模型中有效抑制单纯疱疹病毒1型复制

　　本研究发现一类新型内切酶抑制剂，其以抗流感药物巴洛沙韦（baloxavir）结构为基础，靶向疱疹病毒关键包装蛋白pUL15，其中先导化合物LN-7在酶活实验（IC50 = 1.56 μM）及细胞抗病毒实验（EC50 = 2.8 μM）中均表现出强抑制活性。研究证实LN-7在大鼠体内具备良好药代动力学特性，且能有效降低HSV-1感染小鼠的病毒载量，为应对耐药性疱疹病毒提供了具有全新作用机制的候选药物。

　　

引言：应对疱疹病毒的药物挑战

疱疹 simplex 病毒（HSV-1 和 HSV-2）是广泛传播的病原体，可导致终身感染，且现有疗法无法将其根除。尽管阿昔洛韦（acyclovir）等病毒DNA聚合酶抑制剂已被广泛应用，但耐药性问题——尤其在免疫缺陷患者中——仍是治疗失败的主要威胁。近年来，虽然已有靶向解旋酶-引物酶复合物的新药（如普瑞替韦pritelivir和阿梅那韦amenamevir）获批，但开发新机制的抗病毒药物仍是迫切需求。本研究聚焦于HSV-1病毒基因组包装过程中的关键蛋白——pUL15内切酶，该酶是病毒包装马达/终止酶复合体的组成部分，其功能对病毒复制至关重要。

化学合成与构效关系研究

研究团队设计并合成了一系列基于巴洛沙韦酸（baloxavir acid）结构的取代多环吡啶酮类衍生物。巴洛沙韦本身是用于流感的内切酶抑制剂，其活性依赖于与金属离子螯合的核心药效团。研究人员保留了该三环螯合结构，重点改造了其三嗪酮环第2位的疏水区域，通过Suzuki反应等步骤引入芳基和联芳基取代基，最终获得40个目标化合物（编号为1–40）。

通过酶活性抑制实验，团队发现简化巴洛沙韦结构（如用甲基或乙基替代下部三环）的化合物（如化合物2和3）抑制活性反而优于巴洛沙韦酸本身。进一步的构效关系（SAR）分析表明，在2位引入苯基或联苯基可显著增强对pUL15C内切酶活性的抑制。其中，化合物17（代号LN-7）的抑制活性最为突出，其IC₅₀值达到1.56 ± 0.16 μM。研究还发现，在远端苯环对位（para-）引入极性基团（如氨基、羧基或酰胺基）有助于提高抑制活性，而非极性基团或过大体积取代（如芘基）则会导致活性下降。

抗病毒活性与机制验证

在细胞水平上，研究人员评估了所有化合物对表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组HSV-1（K26株）的抗病毒效果。结果显示，有5个化合物（7、10、17、30和34）表现出显著抑制活性，其中LN-7的EC₅₀值为2.8 ± 1.1 μM，优于天然产物β-thujaplicinol（EC₅₀ = 3.9 μM），但略逊于阿昔洛韦（EC₅₀ = 0.68 μM）。值得注意的是，LN-7对阿昔洛韦耐药毒株（如F-TKGF和Δ305）以及HSV-2病毒同样有效，其EC₅₀与对野生型HSV-1的抑制浓度相当，表明其作用机制不同于现有DNA聚合酶抑制剂。

为确定LN-7的作用时相，团队进行了时间加入实验（time-of-addition experiments）。结果表明，LN-7在病毒感染后加入仍能有效抑制病毒复制，其行为模式与阿昔洛韦和β-thujaplicinol相似，提示其作用于病毒DNA复制之后的阶段，与pUL15在病毒基因组包装中的功能一致。此外，LN-7与阿昔洛韦联用表现出协同效应（combination index, CI < 1），这为未来联合用药克服耐药提供了实验依据。

分子模拟揭示结合机制

为深入理解LN-7与靶点的相互作用，研究团队通过分子动力学模拟（MD）分析了LN-7与HSV-1 pUL15C结构域的结合模式。他们基于PDB 4IOX晶体结构，补全了缺失环区并引入Mn²⁺离子以模拟活性中心。模拟结果显示，LN-7的三环螯合结构与活性位点的两个Mn²⁺离子配位，其联苯基中的近端苯环与Phe512和Arg695形成π-堆叠和阳离子-π相互作用，这一结合姿态可能阻碍DNA底物进入酶切中心，从而抑制其内切酶活性。点突变实验证实，将Phe512或Arg695突变为丙氨酸会显著降低pUL15C的催化活性，进一步验证了这些残基在酶功能及抑制剂结合中的关键作用。

药代动力学与体内药效

LN-7在大鼠模型中表现出良好的药代动力学特性：口服生物利用度（F）达48.4%，半衰期（T_1/2）约5.5–6.2小时，且缓慢清除。安全性实验中，BALB/c小鼠连续5天口服LN-7（最高75 mg/kg）未出现明显毒性反应，血液学及肝肾功能指标均正常。

在HSV-1感染的小鼠模型中，LN-7无论是作为预防用药（感染前一天开始给药）还是治疗用药（感染后给药），均能显著降低肺、脑、嗅球及脾组织中的病毒滴度，效果与阿昔洛韦相当。联合用药组（LN-7 + 阿昔洛韦）虽未显著增强病毒抑制，但减轻了感染相关的临床症状（如竖毛、嗜睡、眼睑闭合等）。所有治疗组小鼠均存活至实验结束，而对照组则出现死亡和明显发病。

讨论与展望：首类靶向病毒包装的抗疱疹药物

本研究表明，基于巴洛沙韦结构设计的新型内切酶抑制剂可通过靶向HSV-1 pUL15C有效抑制病毒复制。其中先导化合物LN-7不仅具备优异的酶活抑制性和细胞抗病毒效果，更在大鼠和小鼠模型中展现出良好的药代动力学特性与安全性，且对耐药毒株有效。该研究首次证明以疱疹病毒终止酶内切酶为靶标的药物开发策略可行，LN-7也因此成为首类（first-in-class）作用于病毒基因组包装阶段的抗疱疹候选药物，为应对不断出现的耐药性问题提供了新方向。未来研究可进一步优化LN-7的类药性质，并探索其与现有药物的协同效应，推动其向临床转化。