基于萘尾锚定抗酶解纳米短肽的构建及其抗细菌感染机制与应用研究

　　本综述系统阐述了通过萘尾锚定策略构建抗蛋白酶水解的纳米短肽N4（序列：Nal-Nal-Nal-Nal-RD-R-R-P），其在生理环境下自组装为纳米纤维，展现广谱抗菌活性（GMMIC = 5.04）和高生物相容性（GMSI = 50.8）。研究通过多尺度技术验证其通过膜破坏（LPS/LTA结合）和能量代谢干扰（ATP抑制、ROS累积）的双重杀菌机制，并在小鼠腹膜炎-败血症和MRSA皮肤感染模型中证实其治疗潜力，为耐药菌感染提供了新型肽基纳米材料解决方案。

　　

1 引言

抗生素的滥用导致多重耐药菌（MDR）的涌现，严重威胁全球公共卫生安全。抗菌肽（AMPs）作为宿主免疫系统的重要组成部分，因其广谱抗菌性和低耐药诱导性受到广泛关注。然而，AMPs的高蛋白酶敏感性限制了其临床应用。本研究基于短肽抗酶解基序“R^DRRP”（含D型精氨酸），通过引入不同疏水基团（脂肪链/芳香环）和修饰策略（完全替代/尾锚定），构建了一系列纳米短肽，旨在增强其蛋白酶抗性和抗菌活性。

2 结果与讨论

2.1 疏水修饰介导的纳米短肽库构建与表征

通过固相合成法成功制备了A_n（丙氨酸模板）、C_n（脂肪链替代）、B_n/N_n（丁基/萘基尾锚定）系列肽（纯度>95%）。临界聚集浓度（CAC）和1,8-ANS荧光分析表明，含C₁₄以上脂肪链、三联苯以上芳香环或≥5个丁基/萘基的肽均具备自组装能力。其中萘尾锚定的N_n系列（如N₄）因π-π堆积和阳离子-π相互作用，表现出更强的自组装倾向（CAC = 5.78 × 10^?6 m）。

2.2 纳米短肽的体外生物活性系统评价

最小抑菌浓度（MIC）测试显示，N₄对革兰阴性菌（如大肠杆菌ATCC 25922）和革兰阳性菌（如金黄色葡萄球菌ATCC 29213）均具有高效抗菌活性（GM_MIC = 5.04 × 10^?6 m），且细胞毒性低（哺乳动物细胞存活率>50%）。溶血实验证实其安全性（HC₂₀ > 128 × 10^?6 m），选择性指数（GM_SI = 50.8）显著优于其他修饰肽。

2.3 生理屏障下高效纳米短肽的筛选

在生理盐离子（Na⁺/Ca²⁺）和血清环境中，N₄保持稳定抗菌活性，而脂肪链替代肽（C_n）因血清白蛋白结合而失活。蛋白酶（胰蛋白酶/糜蛋白酶/胃蛋白酶）处理实验显示，N₄在8 mg mL^?1浓度下孵育8小时后仍保持结构完整性（SDS-PAGE和HPLC验证）。时间杀菌曲线证实N₄在1×MIC浓度下1500秒内完全杀灭大肠杆菌。连续传代30天后，N₄未诱导耐药性（MIC不变），而庆大霉素耐药性提高128倍。

2.4 优选纳米短肽N₄的自组装特性全面研究

分子动力学（MD）模拟显示N₄在100 ns内通过疏水作用和氢键形成稳定聚集体。硫黄素T（ThT）荧光和负染透射电镜（TEM）证实其形成纳米纤维结构（直径100–600 nm）。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和X射线光电子能谱（XPS）分析揭示其β-折叠构象（占比49.88%）和芳环π-π跃迁特征。圆二色谱（CD）显示其在SDS环境中仍维持α-螺旋/β-折叠混合构象。

2.5 纳米短肽的整体抗菌机制研究

机制研究表明，N₄通过静电作用优先结合脂多糖（LPS）和脂磷壁酸（LTA），破坏细菌外膜（NPN渗透性实验）。继而诱导细胞膜去极化（DiSC₃-5荧光增强）和内容物泄漏（PI/SYTO 9染色）。内部化后抑制呼吸链脱氢酶活性（红四氮唑还原实验），降低ATP水平（萤光素酶法），并引发活性氧（ROS）累积。扫描电镜（SEM）和TEM显示细菌膜皱缩、破裂和内容物泄漏。高浓度N₄（256 × 10^?6 m）还可通过聚集效应促进细菌凝集。

2.6 体内生物相容性及细菌感染治疗评价

小鼠毒性实验表明，N₄（20 mg kg^?1）未引起显著体重变化或器官损伤（肝肾功能指标正常）。在大肠杆菌诱导的腹膜炎-败血症模型中，N₄处理（10 mg kg^?1）显著降低肝脏、脾脏和肾脏细菌载量（降低0.8–1.1 log₁₀ CFU），并调节炎症因子（降低IL-1β/IL-6/TNF-α，升高IL-10）。免疫荧光显示其促进脾脏M2型巨噬细胞极化（CD206⁺）。在MRSA皮肤感染模型中，N₄（5 mg kg^?1）加速伤口愈合，减少细菌定植（第9天降低0.77 log₁₀ CFU g^?1），并促进胶原沉积（Masson染色）和血管生成（CD31⁺表达）。

3 结论

本研究通过萘尾锚定策略成功构建了具有蛋白酶抗性的纳米短肽N₄，其通过自组装形成纳米纤维，整合膜破坏与能量代谢干扰的双重杀菌机制，并在体内模型中验证其疗效和生物安全性，为耐药菌感染提供了新型治疗策略。

4 实验方法

肽合成采用固相合成法，抗菌活性通过微量肉汤稀释法测定，细胞毒性使用MTT法评估。自组装特性通过CAC、ThT荧光和TEM表征。抗菌机制涉及LPS/LTA结合、膜电位检测和ATP/ROS水平测定。动物实验遵循东北农业大学伦理指南（NEAU-[2011]-9），使用ICR小鼠模型进行毒性和疗效评价。数据统计分析采用GraphPad Prism 9.5，差异显著性通过t检验或单因素ANOVA判定。