二维与三维培养间充质干细胞的代谢组与转录组比较分析：提升治疗应用的新视角

　　本刊推荐：本研究通过整合代谢组学（1H-NMR）与转录组学（RNA-seq）技术，系统比较二维（2D）与三维（3D）培养条件下间充质干细胞（MSCs）的代谢重编程和基因表达差异。结果显示3D培养促进MSCs干性维持并降低增殖活性，其独特的代谢适应（如糖酵解增强和氨基酸代谢改变）与治疗潜力提升密切相关，为优化干细胞疗法提供了关键理论依据。

　　

背景与目的

间充质干细胞（MSCs）因其多向分化潜能和免疫调节特性，在再生医学中具有广泛应用前景。传统二维（2D）单层培养虽简便经济，却难以模拟体内微环境，易导致干细胞特性丢失。三维（3D）培养通过细胞-细胞相互作用和细胞-基质交互，更好地模拟生理条件，有望增强MSCs的治疗效果。本研究旨在系统分析2D与3D培养对MSCs行为、增殖及功能特性的影响，从代谢与基因层面揭示其调控机制。

方法概要

研究使用C57BL/6小鼠皮下脂肪组织分离MSCs，并通过多向分化实验和流式细胞术检测其表面标志物（CD90、CD44、CD29、Sca-1等）进行鉴定。2D培养采用常规贴壁培养法，3D培养则使用AggreWell? 400微孔板形成细胞球体。通过活死染色（AO/PI）和CCK-8法评估细胞活性，PicoGreen法进行DNA定量以反映增殖情况。

代谢组学分析方面，采用甲醇-氯仿-水体系提取极性代谢物，运用600 MHz ¹H-NMR谱仪（NOESY预饱和脉冲序列）采集数据，并通过Chenomx软件进行代谢物鉴定与定量。多变量统计分析使用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型，并通过置换检验验证模型可靠性。

转录组学分析则提取总RNA进行测序，使用DESeq2进行差异表达分析，通过clusterProfiler等R包进行基因集富集分析（GSEA），挖掘2D与3D培养条件下的差异表达基因和信号通路。

主要结果

细胞形态与增殖

3D培养的MSCs形成直径180–220 μm的球体，细胞间连接紧密，形态趋于圆形，更接近体内组织构造。2D细胞则呈现典型的纺锤形纤维母细胞样形态。细胞活性在两种培养条件下均较高，但3D培养中细胞增殖显著减缓，DNA含量明显低于2D组，说明3D微环境诱导MSCs进入静止状态。

代谢组学特征

2D培养的MSCs表现出更高的代谢活性。其ATP、ADP、AMP、肌酸（Cr）、磷酸肌酸（CrP）等能量相关代谢物水平显著上升，表明2D环境具有更高的能量电荷和增殖状态。此外，2D组中糖酵解终产物乳酸（LA）、氨基酸（如谷氨酸Glu、谷氨酰胺Gln、丙氨酸Ala、苏氨酸Thr等）以及膜合成相关代谢物（如磷酸胆碱PC、甘油磷酸胆碱GPC）均明显上调，反映其活跃的生物合成和细胞生长。

相比之下，3D MSCs整体代谢水平较低，糖利用与乳酸积累较为受限，表明其代谢更趋节能，与低氧适应和细胞静止状态一致。牛磺酸（Tau）和亚牛磺酸（HypTau）在两种培养方式中均随时间上升，可能在氧化应激调节和细胞内环境平衡中发挥作用。

转录组学分析

基因表达分析显示，3D与2D培养之间存在显著转录差异。3D条件下与离子跨膜转运、G蛋白偶联受体活性、细胞氧化还原平衡等相关的基因集明显富集，如Trpm2、Kcnb1、Txnrd2、Nfe2l2和Prdx1–4等基因表达上调。这些基因参与细胞信号转导、代谢调节与抗氧化反应，说明3D培养能更好地模拟体内复杂环境，调控MSCs功能。

同时，3D中核糖体生物合成和细胞周期相关基因表达下调，进一步验证其增殖减缓、倾向于功能特化而非快速分裂。

讨论与意义

本研究发现3D培养环境通过代谢重编程促使MSCs转向静止状态，并增强其干性与抗逆能力。这种代谢适应与细胞内氧化还原平衡、能量代谢调节和基因表达改变密切相关，可能提升MSCs的免疫调节和组织修复能力。研究强调了培养条件对细胞功能的深远影响，为干细胞治疗提供了优化策略和潜在代谢标志物。

结论

该研究通过多组学整合分析，揭示3D培养通过调控代谢和转录程序促进MSCs功能成熟，具有重要的转化价值。未来需进一步开展体内实验验证这些发现，推动干细胞治疗在临床中的应用。