人类胎盘滋养细胞对克氏锥虫感染的差异性易感性研究

　　本研究针对克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）先天性传播机制不明的问题，通过建立三种滋养细胞模型（CT/ST/EVT）并比较TcI与TcII株系的感染特性，发现滋养细胞亚型存在显著感染差异性，CT细胞高易感而ST细胞具天然抗性，EVT细胞支持长期寄生虫释放。揭示了胎盘防御机制与虫株毒力差异，为先天性恰加斯病防治提供新见解。

　　

先天性恰加斯病是由克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起的经胎盘传播的人畜共患病，是拉丁美洲地区严重的公共卫生问题。据世界卫生组织估计，拉丁美洲约有112.5万育龄妇女感染克氏锥虫，每年先天性感染发生率达8668例。随着人口迁移，非流行区的先天性传播也成为日益严峻的挑战。先天性感染与不良妊娠结局相关，包括宫内生长受限、新生儿死亡风险增加、早产、低出生体重和死胎。虽然60%-90%的先天性感染病例在出生时无症状，但未经治疗的感染可导致严重的长期并发症，如心肌病。

克氏锥虫通过血液中的锥鞭毛体（trypomastigotes）从母体传播给胎儿，但其穿越胎盘屏障的细胞机制仍不清楚。胎盘作为胎儿保护屏障，其绒毛绒毛表面覆盖着由合体滋养细胞（syncytiotrophoblast, ST）形成的连续层，ST来源于其下方的细胞滋养细胞（cytotrophoblast, CT）。ST细胞具有强大的抗病原体能力，对多种病毒、细菌和寄生虫包括克氏锥虫表现出天然抵抗力。相反，CT细胞和绒毛外滋养细胞（extravillous trophoblast, EVT）则更容易感染。目前关于克氏锥虫穿越胎盘屏障的机制存在三种假说：直接侵入滋养细胞、破坏ST层使寄生虫渗透、或通过缺乏滋养细胞的区域感染成纤维细胞和巨噬细胞。这些机制受到妊娠期间胎盘结构变化的显著影响。

克氏锥虫分为六个离散分型单元（DTUs），从TcI到TcVI，这些基因型可能与生物学、流行病学和临床特征相关。不同基因型的克氏锥虫及其致病特征可能在先天性感染中起关键作用。近期研究发现，一些自然分离的垂直传播虫株尽管寄生虫血症水平低，却能到达胎盘并传播给胎儿，且与参考虫株相比能差异调节胎盘基因表达，表明其具有特殊的免疫逃避策略。

本研究旨在表征不同滋养细胞亚型对克氏锥虫的差异性反应，特别关注绒毛外滋养细胞（EVT）样细胞，因为它们在早期胎盘侵入中的核心作用及其可能暴露于循环寄生虫。研究人员首先检查了绒毛和绒毛外滋养细胞系对代表性TcI虫株（SA）的易感性，随后通过比较多种克氏锥虫虫株侵入和在EVT样细胞中复制的能力来评估虫株特异性差异。

研究采用的主要技术方法包括：三种滋养细胞模型（BeWo CT样细胞、FSK诱导的BeWo ST样细胞和HTR-8/SVneo EVT样细胞）的建立与培养；克氏锥虫虫株（三个哥伦比亚TcI虫株和一个巴西TcII虫株）的体外代谢循环生成；细胞感染实验与细胞内寄生虫计数；锥鞭毛体释放动力学分析；细胞毒性检测（LDH法）；激素分泌检测（hCG ELISA）；细胞凋亡流式分析；以及扫描电镜超微结构观察。

研究结果通过多个维度揭示了滋养细胞与克氏锥虫相互作用的复杂性：

"Human trophoblasts exhibit differential permissiveness to T. cruzi"部分显示，所有三种细胞系（BeWo CT样、BeWo ST样和EVT样）都能被克氏锥虫SA虫株成功感染，但感染率存在显著差异。BeWo ST样细胞对感染表现出最强的抵抗力，整个感染时间线中的感染率最低，平均最大值为16%±1%。相反，CT样细胞的感染率最高，从24 hpi的35%±1.1%到120 hpi的96%±2.6%。EVT样细胞表现出中等易感性，感染率从13%±1.5%到72.6%±1.2%。用Y虫株感染不同滋养细胞群体也观察到类似的趋势。

"Extravillous Trophoblast supports increased intracellular parasite load over time"部分表明，虽然所有滋养细胞系在24 hpi都能检测到细胞内寄生虫，但96和120 hpi时寄生虫数量显著增加。CT样细胞每个细胞携带的寄生虫数量多于ST样和EVT样细胞。有趣的是，在EVT样细胞中，克氏锥虫感染刺激了hCG的产生，这可能与细胞损伤有关。LDH检测显示，EVT样细胞支持细胞内寄生虫随时间的逐渐增加。在ST样细胞中，寄生虫数量每72小时达到峰值，表明裂解周期约为72小时而非120小时。

"Extravillous Trophoblast supports long-term release of T. cruzi"部分发现，感染细胞上清液中寄生虫释放监测21天或直到大部分细胞被破坏。Vero细胞（对照）释放的细胞源性锥鞭毛体在第4天检测到，数量在整个21天随访期间显著增加。BeWo ST样细胞源性的锥鞭毛体在第7天检测到，但水平较低，在第13天达到峰值。BeWo CT样培养物中的锥鞭毛体早在48 hpi就能检测到，在第7天达到峰值。由于广泛的细胞死亡，BeWo CT样培养物中的锥鞭毛体释放只能测量到第9天。EVT样细胞支持完整的细胞内生命周期，锥鞭毛体释放从第7天开始并显著增加直到第21天。

"Extravillous Trophoblast promotes the release of T.cruzi intermediate forms"部分通过电镜评估了滋养细胞释放的寄生虫形态特征。观察到一个多形性的锥鞭毛体群体，包括细长和宽阔的锥鞭毛体。感染的细胞还释放其他形式，特别是在EVT样细胞中，包括无鞭毛体（amastigotes）和具有短长鞭毛的过渡形式。其中一些中间形式的形态类似于上鞭毛体（epimastigotes），这与其它研究报道一致。

"Extravillous Trophoblast exhibits low cytotoxicity during T. cruzi infection"部分通过测量培养上清中的LDH活性作为膜损伤指标评估了感染对细胞活力的影响。在BeWo ST样细胞中，LDH活性在24、72和120 hpi显著高于未感染对照。在BeWo CT样细胞中，显著的活力丧失仅在96 hpi后观察到，LDH活性在120 hpi达到更高水平。一个突出的发现是感染对EVT样细胞活力的影响较低。这些细胞在96 hpi观察到显著的膜损伤。

"hCG production in trophoblast cells is differentially affected by the T. cruzi infection"部分显示，与BeWo CT样和EVT样细胞相比，BeWo ST样细胞中的hCG产量显著更高。与未感染培养物相比，感染ST和CT细胞中的hCG水平显著降低。在BeWo ST样细胞中，随着感染进展观察到hCG浓度逐渐降低，而与感染BeWo CT样细胞在24 hpi检测到的hCG水平下降形成对比。有趣的是，在EVT样细胞中，克氏锥虫感染刺激了hCG产生。

"In vitro metacyclogenesis rates, infectivity, and pathogenicity varied between strains of T. cruzi"部分评估了四种克氏锥虫虫株的感染性，这些虫株具有不同的代谢循环发生动力学。代谢循环发生的开始发生在第二到第三天，持续约3到5天。SN3虫株的代谢循环锥鞭毛体平均数量显著更高，其次是SA虫株。GAL61S克隆表现出最低的代谢循环锥鞭毛体产量。所有虫株在EVT样细胞中都能建立生产性感染，感染细胞百分比从24 hpi的13-31%增加到96 hpi的35-48%。然而，120 hpi后差异变得明显，Y虫株（TcII）表现出最高的感染细胞百分比（95%），其次是TcI虫株SA（73%）、SN3（41%）和GAL61S（20%）。

"The T. cruzi strains exhibited distinct cytotoxicity patterns in EVT-like cells"部分证明，不同虫株在EVT样细胞中表现出不同的细胞毒性模式，如感染期间LDH释放所示。评估了早期凋亡、晚期凋亡和坏死以确定感染是否直接诱导宿主细胞死亡并确定主要的细胞死亡方式。研究结果表明，坏死在24 hpi占主导地位。相反，早期凋亡在96 hpi成为主要过程，在SN3虫株感染的细胞中观察到最高水平。

研究结论与讨论部分强调，滋养细胞亚型对克氏锥虫感染的差异性易感性强调了滋养细胞异质性在先天性传播中的作用。BeWo CT样细胞似乎高度易感感染和细胞毒性，使其成为通过ST破坏可能可用的关键靶标。相反，BeWo ST样细胞表现出先天抵抗力，而EVT样细胞表现出易感性、恢复力和改变的寄生虫分化的独特组合。这些发现增强了我们对胎盘对感染反应的理解，并强调需要进一步研究滋养细胞-寄生虫相互作用以开发针对先天性恰加斯病的靶向干预措施。

ST细胞的抵抗力可能归因于其分化状态、细胞极性和先天免疫机制的组成性激活。与CT相比，ST中显著上调的基因包括PAPPA、CARD17、TREM1、TMED7-TICAM2、BATF、SLC11A1、IL27、ISG20、MAK8、IP2、MAP1LC3B、LAMP3、IL16、CAPSP1P2、CASP4、TRIM55、ARNT和EIF2AK2。相反，促进细胞粘附的基因如ICAM1和HSPG2（可能促进病原体附着）被下调。富集通路分析显示，与CT相比，ST中IFNα和IFNγ反应通路显著富集。这些先天防御机制可能解释了STB对克氏锥虫等病原体的易感性降低。

另一方面，代表EVT样滋养细胞的HTR-8细胞表现出中等易感性，支持持续的细胞内增殖和随时间的锥鞭毛体释放。蜕膜，尤其是绒毛外滋养细胞，对微生物如CMV、单核细胞增多性李斯特菌和弓形虫高度易感，表明这是胎盘和先天性感染的潜在途径，值得进一步关注。

锥鞭毛体释放的动力学进一步突出了滋养细胞系的差异性允准性。虽然BeWo CT样细胞高度易感感染，但表现出快速的细胞裂解，导致锥鞭毛体的早期释放但第9天感染后存活有限。这反映了对克氏锥虫细胞病变效应和高细胞内寄生虫负荷的关键脆弱性。使用BeWo细胞三维（3D）培养的补充研究也出现了滋养细胞-克氏锥虫相互作用的见解，更好地模拟了绒毛滋养细胞的结构和功能组织。在该模型中，寄生虫虫株之间的差异性感染性也很明显，VD虫株表现出更高的寄生虫负荷。值得注意的是，与CT样球体相比，BeWo ST样球体对感染更具抵抗力，加强了ST作为先天性传播强大屏障的假设。

相比之下，EVT样细胞在整个观察期间维持寄生虫释放，包括大量释放过渡和无鞭毛体形式，可能表明 premature lysis。这些中间形式，被描述为从无鞭毛体到血流锥鞭毛体分化过程的一个阶段，可以维持感染的进展。尽管有显著的细胞内寄生虫病，HTR-8细胞的 prolonged survival 表明EVT样细胞可能作为寄生虫的慢性储存库。这一发现对先天性传播有 implications。

一个有前途的未来研究方向是探索不同滋养细胞亚群中表面受体的可用性，以更好地理解它们对克氏锥虫感染的易感性。潜在受体包括碳水化合物（如半乳糖基、甘露糖基、唾液酸残基），以及 lectin-like 蛋白质如半乳糖凝集素-3（与寄生虫表面的碳水化合物残基（如 mucins）结合），内皮素-1，缓激肽受体，细胞角蛋白18，和细胞外基质成分如纤连蛋白、层粘连蛋白和整合素。半乳糖凝集素-3特别重要，因为其沉默减少了锥鞭毛体对哺乳动物细胞的粘附。

滋养细胞糖基化模式在滋养细胞类型间和妊娠期间变化，可能影响寄生虫-宿主相互作用。值得注意的是，半乳糖凝集素-3在CT细胞中表达但在ST中缺失，在更具侵袭性的滋养细胞和EVT细胞中表达减少。HTR-8细胞中的半乳糖凝集素-3表达也有先前报道。此外，克氏锥虫调节细胞外基质成分并与之相互作用，通过在感染早期利用这些分子招募寄生虫来促进感染。

ST细胞中hCG产生的破坏，滋养细胞分化和功能的关键标志，提供了克氏锥虫有害效应的进一步证据。BeWo ST样和CT样细胞显示hCG水平显著降低，CT样细胞下降更明显，可能反映分化过程的中断和细胞损伤。研究表明，克氏锥虫感染改变人类胎盘中滋养细胞更新动力学，可能造成胎盘屏障缺口，使寄生虫进入绒毛绒毛。此类中断可能损害胎盘功能并对先天性感染期间的胎儿发育产生负面影响。

有趣的是，HTR-8细胞响应克氏锥虫感染表现出hCG产量增加，类似于早期妊娠期间患恶性疟原虫感染的母亲中的观察。在妊娠前三个月，EVT分泌hCG-H亚型，通过内皮细胞上表达的TGFβRII促进滋养细胞侵入和血管生成，并通过自分泌相互作用通过TGF-β信号传导促进生长和侵入表型。hCG-H亚型在结构上模拟TGF-β，增强其与受体的相互作用，减少凋亡，并通过金属蛋白酶激活促进侵入。响应寄生虫的hCG水平增加可能是细胞损伤的后果，也是保护胎盘功能和支持免疫调节的补偿机制。

最后，本研究揭示了四种克氏锥虫虫株之间的 distinct replication dynamics，突出了它们感染性和细胞内行为变异性。Y虫株展示了通过生命周期的最有效进展，具有高晚期感染性、晚期无鞭毛体复制和锥鞭毛体释放之间的强相关性。该虫株在早期阶段（24和48 hpi）显示较低的无鞭毛体计数，但在后期时间点（96和120 hpi）主导细胞内复制。其低过渡阶段释放表明发育有利于锥鞭毛体生产。相比之下，SA虫株尽管在24 hpi具有高感染性，但表现出低细胞内无鞭毛体复制和锥鞭毛体释放，但高过渡阶段释放，表明通过发育阶段不完全或延迟。克隆GAL61S维持中等感染性、细胞内复制和锥鞭毛体释放，以及显著的过渡阶段释放。SN3显示有限的感染性、细胞内无鞭毛体复制和锥鞭毛体释放。但仍然诱导更高的早期凋亡率，表明即使少量无鞭毛体也能触发显著的早期细胞死亡。这些发现强调感染性并不总是与无鞭毛体的复制成功直接相关，强调了虫株特异性因素在寄生虫存活、复制和整体发病机制中的关键作用。

然而，所有克氏锥虫DTUs先天性传播的潜力仍然不确定，因为目前没有 conclusive evidence 表明特定DTUs更可能在子宫内传播。与Cáceres等人的发现相反，TcI分离株SN3和SA表现出比TcII（Y）虫株更大的代谢循环发生潜力。然而，在感染时，TcII表现出更高的感染率。TcI和TcII之间的差异先前已有报道，并与热休克蛋白、细胞表面分子和其他抗应激相关因子表达增加，以及寄生虫与宿主免疫系统之间的 distinct interactions 相关。如我们结果中观察到的 intra-DTU diversity 已导致对该DTU细分的提议。值得注意的是，代谢循环发生和感染性的变化不仅发生在DTUs之间，而且发生在同一DTU内的虫株之间。

克氏锥虫虫株是多克隆的。这一特征也可能影响感染，因为具有更多克隆的虫株可能拥有增强某些特性的基因型，允许更大的感染性。由于SN3虫株从载体分离，更多克隆可能诱导更多细胞死亡。相反，从人类分离的SA虫株可能被选择用于表现出在该细胞类型中较低感染性的特定克隆。此外，利用克隆可能通过消除与其他克隆的竞争或影响来促进特定过程。

这些差异以及形态变异性可能受到虫株来源的影响。已知锥虫（包括克氏锥虫）携带表观遗传修饰，这些修饰在生命周期阶段间变化。这些寄生虫中的基因表达调控很大程度上取决于转录后网络，如TcUBP1的作用所证明。这种RNA结合蛋白促进从上鞭毛体到代谢循环锥鞭毛体的分化过程启动。此外，不同克氏锥虫虫株表达 distinct surface molecules，与宿主成分相互作用以促进哺乳动物细胞侵入。这些包括分子如gp90、Tc85、gp82和gp35/50。此外，寄生虫覆盖着一层 dense layer of mucin-type glycoproteins，其碳水化合物残基与宿主细胞表面相互作用。