外泌体通过STAT3-Notch-Wnt信号通路串话调控三阴性乳腺癌肿瘤发生的作用与机制

　　本研究针对三阴性乳腺癌(TNBC)治疗抵抗和转移机制不明确的难题，探讨了外泌体(exosomes)通过STAT3信号通路与Wnt/β-catenin和Notch通路的交互对话在促进肿瘤恶性行为中的作用。研究发现TNBC来源外泌体显著增强肿瘤细胞迁移、增殖和化疗抵抗，其机制涉及STAT3介导的Wnt和Notch信号通路激活，为TNBC靶向治疗提供了新思路。

　　

在乳腺癌的各种亚型中，三阴性乳腺癌(Triple Negative Breast Cancer, TNBC)因其缺乏雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)表达而成为最具侵袭性的亚型。TNBC患者面临治疗选择有限、化疗抵抗和快速转移的严峻挑战，预后普遍较差。肿瘤微环境中的细胞间通讯在癌症进展中发挥着关键作用，而外泌体(exosomes)作为纳米级的细胞外囊泡，正日益被认为是这种通讯的重要媒介。这些微小囊泡能够携带蛋白质、RNA和DNA等生物活性分子，在细胞间传递信息，影响肿瘤的发生、发展和治疗反应。

尽管既往研究已提示外泌体可能参与肿瘤进程，但关于它们如何通过调节关键信号通路来影响TNBC的肿瘤发生行为，特别是与信号转导和转录激活因子3(STAT3)、Wnt和Notch这些已知在癌症中重要的信号通路之间的相互作用，仍缺乏深入系统的研究。STAT3信号通路在TNBC免疫逃逸中起关键作用，其致癌潜力通过调节与肿瘤发生行为、化疗抵抗、免疫抑制和干细胞自我更新相关的基因表达而广为人知。同时，Wnt和Notch信号通路也在乳腺癌特别是TNBC的发病机制和进展中扮演重要角色。然而，这些通路之间如何通过外泌体进行交互对话，从而共同促进TNBC的恶性进展，仍是未解之谜。

为了解决这一科学问题，由Shymaa Abdullah Mohamed领衔的研究团队在《Discover Oncology》上发表了一项创新性研究，系统地探讨了外泌体在通过STAT3、Notch和Wnt信号通路之间的串话调节TNBC肿瘤发生行为中的作用。他们的工作不仅揭示了外泌体促进TNBC恶性表型的分子机制，还为开发针对这一侵袭性乳腺癌亚型的新的治疗策略提供了重要理论基础。

研究人员采用多项关键技术开展本研究。从一名III级IV期TNBC患者血清中分离外泌体，通过超速离心法纯化，使用扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)进行形态学表征，Western blot技术检测外泌体表面标志物(CD63、Alix、TSG101)。研究选用三种乳腺癌细胞系：MDA-MB-231(间质样TNBC)、HCC1806(基底样TNBC)和MCF7(非TNBC)。采用MTT法测定AG490(STAT3抑制剂)和阿霉素(DOXO)的半抑制浓度(IC₅₀)，通过Western blot评估STAT3通路抑制效率。细胞功能实验包括划痕实验检测迁移能力和集落形成实验评估增殖能力。使用qRT-PCR技术分析Wnt信号通路(β-catenin、Cyclin D1、WNT1、AXIN2)和Notch信号通路(NOTCH1、NOTCH2、JAG1、HES1、DLL4)相关基因表达。

研究结果方面，尺寸表征显示分离的外泌体呈双凹形状，大小在100-300纳米之间，以大亚类为主。表面蛋白表征表明分离的外泌体CD63、PCD6IP(Alix)和TSG101阳性，其中CD63蛋白表面标志物的强度大于PCD6IP(Alix)和TSG101蛋白。外泌体摄取效率实验发现TNBC细胞系对外泌体的摄取效率更高，MDA-MB-231细胞的摄取略高于HCC1806细胞，而非TNBC细胞系(MCF7细胞)的摄取效率较低。

细胞毒性测试显示AG490和DOXO处理48小时可抑制TNBC和NTNBC细胞系的生长，效果显著不同。AG490对MDA-MB-231、HCC1806和MCF-7细胞的IC₅₀值分别为25.4±0.009、44.16±0.026和96.07±0.042 μM。DOXO对MDA-MB-231、HCC1806和MCF-7细胞的IC₅₀值分别为1.72±0.001、15.17±0.003和8.34±0.009 μM。结果表明MDA-MB-231细胞对AG490和DOXO的敏感性高于其他两种细胞系。

STAT3信号通路评估表明，使用AG490处理可有效抑制三种细胞系中的STAT3信号通路，在MCF7细胞中效果最显著，在MDA-MB-231细胞中效果最弱。乳腺癌细胞系中的抑制水平与它们对AG490的敏感性呈负相关。

细胞形态学观察发现，用外泌体处理TNBC细胞后，上皮细胞呈现细长的纺锤形结构。然而，用外泌体处理的MCF7细胞形成聚集体和团块。用DOXO处理的MDA-MB-231和MCF7细胞存在圆形脱落细胞和碎片，DOXO对MCF7细胞的影响比MDA-MB-231细胞更明显。用EXO-DOXO处理的TNBC细胞比单独用DOXO处理的细胞具有更细长的纺锤形结构。用EXO-DOXO处理的NTNBC细胞显示细胞聚集体和团块。

迁移实验表明，用外泌体处理TNBC和NTNBC细胞完全愈合了肿瘤闭合区域(100%)。DOXO处理TNBC细胞导致MDA-MB-231细胞(64±6.5%)和HCC1806细胞(71±4.6%)的闭合面积显著减少，NTNBC细胞系MCF7(88±1.1%)的减少不显著。用EXO-DOXO处理TNBC细胞和NTNBC细胞显著增加了MDA-MB-231(100%)、HCC1806(80±1.1%)和MCF7细胞(98±0.46%)的闭合面积。

集落形成实验显示外泌体处理增加了TNBC和NTNBC细胞的致瘤效果，与未处理细胞相比，集落百分比显著更高。HCC1806细胞的集落形成最多(135±6.8%)，其次是MCF7细胞(118±2.0%)和MDA-MB-231细胞(116±4.8%)。DOXO处理对MDA-MB-231、HCC1806和MCF7细胞表现出抗肿瘤效果，细胞集落形成减少分别为44±6.4%、46±4.1%和71±4.5%。

信号通路评估中，Wnt信号通路方面，外泌体处理显著增加了MDA-MB-231细胞中β-catenin、Cyclin D1、WNT1和AXIN2的表达。在HCC1806细胞中，只有β-catenin表达显著增加。在MCF7细胞中，外泌体处理显著增加了β-catenin和Cyclin D1的表达。Notch信号通路方面，与不处理相比，用外泌体处理显著增加了MDA-MB-231细胞中NOTCH2、JAG1、HES1和DLL4的表达。在HCC1806细胞中，处理显著增加了NOTCH1、NOTCH2和HES1表达。在MCF7细胞中，未观察到Notch通路信号基因表达的显著变化。

研究结论和讨论部分指出，外泌体在增强和促进TNBC的肿瘤发生行为中扮演关键角色。机制上，外泌体可能通过STAT3介导的Wnt信号通路在TNBC和NTNBC细胞中表现出肿瘤发生性侵袭特征，同时通过STAT3通路介导的Notch信号通路在TNBC中发挥肿瘤发生作用。而在NTNBC中，外泌体可能通过不依赖于STAT3通路的Notch信号通路发挥其肿瘤发生作用。

这些发现具有重要的临床意义。首先，研究证实了外泌体作为TNBC肿瘤微环境中关键通讯分子的作用，为理解TNBC的恶性进展提供了新视角。其次，研究揭示了STAT3-Wnt-Notch信号通路网络在TNBC中的复杂交互作用，为开发多靶点治疗策略提供了理论依据。第三，研究发现外泌体能够促进化疗抵抗，提示联合靶向外泌体生成或功能的策略可能增强现有化疗方案的效果。最后，研究结果表明不同乳腺癌亚型对外泌体的反应存在差异，强调了个性化治疗策略的重要性。

该研究的创新性在于系统阐明了外泌体通过调控多个信号通路网络影响TN肿瘤发生行为的机制，为开发针对这一侵袭性乳腺癌亚型的新的诊断和治疗策略提供了重要理论基础。未来研究可进一步探索靶向外泌体或相关信号通路作为TNBC治疗新策略的可行性，以及外泌体作为TNBC预后生物标志物的潜在价值。