小鼠主动脉瓣反流微创手术新模型：心脏重塑机制与特征基因挖掘

　　本刊推荐：为解决主动脉瓣反流（AR）动物模型缺乏临床相关性及操作复杂的问题，研究人员开发了一种超声引导下微创主动脉瓣反流手术（MiARS）小鼠模型，并通过多模态分析验证了其临床特征。研究结合时间序列分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA），鉴定出与AR诱导瓣膜性心脏病（VHD）密切相关的特征基因，为机制研究和潜在治疗靶点探索提供了全面见解。

　　

在心血管疾病领域，主动脉瓣反流（Aortic Regurgitation, AR）正逐渐成为一个不容忽视的健康问题。这种由主动脉瓣病变或主动脉根部形态异常引起的疾病，会导致左心室进行性扩张和偏心性肥厚，最终进展为心力衰竭（Heart Failure, HF）。尽管AR的总体患病率达到1.2%，且随年龄增长而增加，但由于患者可能长期无明显临床症状，其严重性常常被低估。目前，临床上对急性重度AR患者主要采用主动脉瓣保留根部置换和瓣膜修复手术，而对不适合手术或无症状的中重度AR患者则使用血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂。然而，药物治疗效果有限，部分原因在于对AR诱导心肌功能障碍的机制理解不足，而这又归因于缺乏临床相关且易于操作的小鼠疾病模型。

现有AR研究大多使用药物诱导或基因修饰动物模型，如培高利特治疗或krox20基因缺失。近年来，虽然开发了通过右颈总动脉在超声引导下穿刺主动脉瓣的手术诱导AR动物模型，但与无手术模型相比，其操作技术要求高，且术后需永久结扎右颈总动脉，最关键的是，该模型可能因术中主动脉根部损伤而导致过度反流和大出血致命风险，这些局限性阻碍了现有AR手术模型的广泛应用。

针对这一难题，来自复旦大学附属中山医院和上海市心血管疾病研究所的研究团队开展了一项创新性研究，开发了一种新型的小鼠AR模型构建方法，并深入探索了AR诱导心脏重塑的机制。研究成果发表在《JACC: Basic to Translational Science》上，为AR研究提供了重要的工具和见解。

研究人员开发了一种名为微创主动脉瓣反流手术（Minimally Invasive Aortic Regurgitation Surgery, MiARS）的新技术，使用改良的胰岛素针在超声引导下以闭胸方式撕裂主动脉瓣。通过多模态分析验证了该AR模型的临床相关特征，并结合时间序列分析和加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）获得了与AR诱导瓣膜性心脏病（Valvular Heart Disease, VHD）密切相关的特征基因。

研究采用了多种关键技术方法：通过MiARS技术建立AR小鼠模型；使用超声心动图和心电图（ECG）评估心功能和传导功能；利用有创血流动力学测量评估心脏和主动脉功能；进行组织学分析评估心肌纤维化和心肌细胞面积；采用RNA测序（RNA-Seq）和时间序列分析研究转录组变化；应用WGCNA筛选特征基因；通过定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）和Western blot验证基因表达。研究使用了56只2-3月龄雄性C57BL/6J小鼠，随机分为假手术组（20只）和AR组（36只）。

成功建立MiARS小鼠模型

研究人员开发的MiARS技术是一种在超声引导下的微创手术，用于建立AR小鼠模型。每次小鼠的手术程序时间（包括麻醉）为4.86±0.34分钟，比之前研究中的约20分钟大大缩短。在胸骨旁长轴超声心动图视图中，使用尖端略微弯曲的改良胰岛素针穿刺心脏前壁。到达主动脉根后，用弯曲端刮伤主动脉瓣。MiARS前，舒张期未见反流。相比之下，MiARS后，胸主动脉中出现舒张期逆行血流，表明AR成功诱导。

MiARS后心脏和主动脉结构与功能的系列超声心动图评估

MiARS后，对左心室的结构和功能变化进行了系列评估。在整个AR观察期间，舒张期和收缩期左心室内径（LVID）从第3天开始逐渐增加，到10周时分别增加了45.70%和89.40%。左心室壁厚度呈现先增厚后变薄的模式，在AR后4周达到最大值。与LVID类似，左心室容积在AR开始后第3天开始显著增加，随后逐渐增加，最终导致10周后舒张期和收缩期容积分别增加了150.43%和380.39%。此外，射血分数（Ejection Fraction, EF）和缩短分数（Fractional Shortening, FS）呈现进行性下降，从AR后4周开始出现显著差异，表明开始出现心功能不全。每搏输出量和心输出量呈现先增加后减少的趋势，与基线条件相比显著增加。

AR和假手术心脏在术后各阶段的多维比较

为了使用多种模态全面评估AR小鼠心脏的改变，对术后2周（代偿期）、4周（失代偿期）和10周（心力衰竭期）的心脏进行了进一步评估。与假手术组相比，AR后2、4和10周小鼠的EF和FS呈现进行性下降，而LVID和收缩期容积显著增加；10周后的变化比2周和4周后更明显。收缩期室间隔（IVS）厚度在2周和4周时显著增加，但在10周时显著减少。收缩期左心室后壁（LVPW）厚度在2周和4周时显著增加；然而，在10周时，差异不再具有统计学意义。

心脏结构和功能的超声心动图变化与相应的血流动力学改变相关。例如，左心室收缩末期压力（LVESP）在AR的2周和4周时显著增加，但在10周时未显示显著差异，这与每搏输出量的变化相对应。此外，在AR后4周和10周，与假手术组相比，实验组左心室压力最大上升和下降速率（dp/dt_max和dp/dt_min）降低，而左心室舒张末期压力（LVEDP）显著升高，表明心功能受损。

通过大体解剖和组织学检查进一步强调了AR后的左心室扩张和偏心性肥厚。随着AR的持续，心脏组织发生重塑。与假手术组相比，AR后2、4和10周心脏逐渐增大；心脏重量/体重比（HW/BW）、左心房重量/体重比（LAW/BW）、左心房面积、心肌细胞大小和纤维化均增加。肥厚标志物Nppa的信使RNA表达水平在4周和10周时也显著升高，同时纤维化标志物Col3a1的表达增加。此外，肺重/体重比（LW/BW）在10周时 dramatically 增加，表明发生充血性心力衰竭。

MiARS前后心脏电传导的系列心电图评估

心肌重塑影响电兴奋和传导；然而，很少有证据来自实验性AR动物模型。因此，使用体表双导联方法在每个时间点进行心电图评估后，对AR后心脏的电生理特征进行了纵向评估。与AR前的基础条件相比，术后各时间点的心率和RR间期没有显著变化。然而，观察到QRS间期、QT间期、JT间期、P波持续时间、T_peak-T_end间期和R波振幅显著增加。PR间期也呈现增加趋势，仅在MiARS后2周和10周达到统计学显著性。

AR后左心室重塑中的基因表达模式和通路分析

为了评估AR小鼠模型中转录组对AR的反应变化，在几个时间点（AR后2、4和10周）进行了RNA测序。RNA测序数据的Principal component analysis表明，每个AR组（2、4和10周）都是一个独立的簇，其中AR后10周组与假手术组的差异最大。

为了探索不同阶段DEG的潜在作用，首先使用fuzzy c-means算法对组间DEG进行聚类分析。分析显示，DEG可分为6个具有清晰 distinct 表达谱的簇。随后，使用clusterProfiler对每个簇进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析，以阐明AR诱导左心室重塑过程中的通路调控。

筛选与AR相关的特征基因发现Ankrd1是容量超负荷特异性基因

将假手术组和AR组（包括2、4和10周）的表达数据输入WGCNA。在过滤掉缺失值和低表达基因后，使用平均距离和Pearson方法对所有样本进行分层聚类后未检测到异常值。当软阈值设置为5时，实现了scale-free R² > 0.85，表明平均连接性高。在设置聚类高度限制0.35和最小模块大小50后合并模块后，总共确定了8个合并模块。

为了进一步了解模块与AR诱导左心室重塑之间的关联，计算了模块与特征（包括分组、EF和舒张末期LVID）之间的相关系数R²值和P值。magenta模块显示与10周AR（R² = 0.89, P = 5e-06）、EF（R² =?0.83, P = 7e-05）和舒张末期LVID（R² = 0.76, P = 6e-04）高度相关，表明具有临床意义。散点图进一步显示，magenta模块与10周AR、EF和舒张末期LVID基于模块成员和基因显著性高度相关。通过应用模块成员>0.8和基因显著性>0.6的筛选条件，从magenta模块中总共确定了125个hub基因。随后，通过Venn图将hub基因与10周AR的高度DEG以及AR后的渐进表达簇基因（簇4和6）进行捕获，得到了4个特征基因：Ankrd1、Fhl1、Efhd2和Nppb。

RT-qPCR验证后，发现Ankrd1和Efhd2与测序结果一致，并且与Nppb表达高度相关。Western blot结果显示，Ankrd1和BNP在AR后各阶段呈现相同的表达趋势，而Efhd2呈现相反趋势。为了研究特征基因在偏心性肥厚心肌中的细胞类型分布，本研究进一步分析了来自扩张型心肌病（Dilated Cardiomyopathy, DCM）患者的单核RNA测序数据。Uniform Manifold Approximation and Projection降维分析显示，在扩张型心肌病背景下，Ankrd1和Nppb主要位于心肌细胞内。

本研究开发了一种名为MiARS的新程序，以高效、微创和可重复的方式生成AR小鼠模型。在10周的随访期间，使用多种模态全面评估了AR小鼠心脏的形态、功能和转录组改变。这项评估使我们能够描述AR诱导心脏重塑的整个谱系，包括即时效应和早期（代偿）、失代偿和充血性心力衰竭阶段。该程序有望显著提高左心室容量超负荷小鼠模型的可用性，用于研究瓣膜反流继发性偏心性心脏肥大的机制和失代偿性心脏病。此外，这项研究可能有助于为经历偏心性肥大的患者制定有效的治疗策略。

研究发现的Ankrd1基因可能作为AR诱导心脏重塑的重要生物标志物和治疗靶点。该基因在心肌细胞中的特异性表达及其与BNP的相似表达模式表明，它在心脏应对容量超负荷的反应中发挥着关键作用。未来的研究可以进一步探索Ankrd1在心脏重塑中的具体功能机制，以及将其作为治疗靶点的潜在价值。

这项研究不仅提供了新的动物模型制作技术，而且通过多时间点的全面分析，揭示了AR诱导心脏重塑的动态过程和相关分子机制，为临床AR的诊断和治疗提供了重要的理论基础和实验依据。