环状RNA circ_0004058通过miR-221-3p/LYVE1通路调控蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的作用与机制研究

　　本刊推荐：为阐明蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑损伤(EBI)的分子机制，研究人员开展了circ_0004058/miR-221-3p/LYVE1调控轴的功能研究。通过体内外实验证实circ_0004058可作为ceRNA吸附miR-221-3p，解除其对LYVE1的抑制，促进LYVE1+CD68+巨噬细胞介导的血管新生，显著减轻EBI。该发现为SAH治疗提供了新的潜在靶点。

　　

在脑血管疾病领域，蛛网膜下腔出血（Subarachnoid Hemorrhage, SAH）是一种危重的出血性脑卒中类型，其发病急、致死率高，严重威胁人类健康。SAH后72小时内发生的早期脑损伤（Early Brain Injury, EBI）是导致患者神经功能缺损和不良预后的主要因素。EBI的病理过程涉及微循环功能障碍、神经炎症、血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）破坏、脑水肿和神经元死亡等多个环节。尽管目前对SAH的研究已取得一定进展，但其具体的分子机制尚未完全阐明，临床仍缺乏有效的靶向治疗策略。

近年来，环状RNA（circular RNAs, circRNAs）作为一类内源性非编码RNA，在神经系统疾病中展现出重要的调控功能。越来越多的证据表明，circRNAs在脑卒中后表达谱发生显著改变，可影响BBB完整性，并具有作为疾病监测生物标志物的潜力。同时，异常表达的circRNAs还能促进血管平滑肌细胞重塑，成为脑出血治疗的潜在靶点。然而，circRNAs在SAH后EBI中的具体作用机制仍有待深入探索。

在此背景下，本研究聚焦于一种新型circRNA——circ_0004058，探讨其在SAH后EBI中的作用机制。通过生物信息学分析，研究人员预测并验证了circ_0004058与miR-221-3p之间的靶向关系，以及miR-221-3p对其下游靶基因淋巴管内皮透明质酸受体-1（Lymphatic Vessel Endothelial Hyaluronan Receptor-1, LYVE1）的调控作用。LYVE1是淋巴管内皮细胞中透明质酸的主要受体，参与树突状细胞转运、内皮细胞通透性调节和血管生成等过程。值得注意的是，骨髓来源的LYVE1阳性巨噬细胞的募集和积累在新生血管形成过程中对于建立致密且有功能的血管网络至关重要。而SAH可诱导免疫细胞大量浸润脑组织，提示LYVE1可能在该过程中发挥关键作用。

本研究旨在揭示circ_0004058是否通过调控miR-221-3p/LYVE1轴影响SAH后的EBI过程，为开发SAH的新的治疗策略提供理论依据和实验基础。

本研究采用多种关键技术方法：首先通过血管内穿孔法建立SAH大鼠模型，并使用神经功能评分、脑水肿测量和组织病理学检查验证模型成功；利用转录组测序和基因芯片分析筛选SAH相关差异表达基因；通过RT-qPCR、Western blotting、免疫组化等技术检测分子表达水平；采用流式细胞术分析LYVE1⁺CD68⁺巨噬细胞数量；通过双荧光素酶报告基因实验、RNA免疫共沉淀（RIP）和RNA pull-down等技术验证分子间相互作用；使用荧光原位杂交（FISH）观察分子共定位情况；还分离培养了大鼠原代海马神经元和脑微血管内皮细胞（rBMECs）进行体外机制研究。

LYVE1 May Have a Key Role in SAH Onset

通过建立SAH大鼠模型，研究人员发现SAH大鼠神经功能评分显著降低，脑水肿程度加重，病理评分升高。Evans blue染色显示BBB通透性显著增加，尼氏染色显示海马区神经元出现大量固缩、细胞器肿胀和质膜完整性丧失，TUNEL染色证实SAH后海马区神经元凋亡增加。转录组测序筛选出24个差异表达基因（DEGs），与GeneCards数据库中的SAH相关基因取交集后，确定LYVE1和TEK为关键基因。由于LYVE1在病理过程中的直接作用更为明确，且其表达下调具有更显著的统计学意义（p=0.0031），故选择LYVE1进行后续研究。RT-qPCR和Western blotting证实SAH大鼠海马组织中LYVE1表达显著降低，流式细胞术显示LYVE1⁺CD68⁺巨噬细胞数量减少，VEGF-A的mRNA和蛋白表达水平也显著下降，免疫组化显示CD31和VEGFA蛋白水平明显降低。

Overexpression of LYVE1 Alleviates Brain Injury, Increases the Number of LYVE1⁺CD68⁺ Macrophages, and Promotes Angiogenesis in SAH Rats

过表达LYVE1可显著改善SAH大鼠的神经功能评分，减轻脑水肿，降低病理评分。脑标本宏观检查显示脑出血量减少，Evans blue染色显示染料外渗减少，尼氏染色显示神经元损伤减轻，TUNEL染色显示神经元凋亡减少。流式细胞术显示LYVE1⁺CD68⁺巨噬细胞数量增加，VEGF-A的mRNA和蛋白表达水平上调，免疫组化显示CD31和VEGFA蛋白水平升高。

miR-221-3p Targets LYVE1 and Inhibits Its Expression

通过miRWalk数据库预测LYVE1的上游miRNAs，并与GSE161870数据集中的差异表达miRNAs取交集，筛选出39个候选miRNAs。鉴于miRNAs通常对其靶基因起负调控作用，研究人员聚焦于在SAH样本中上调的miRNAs，选择其中已被报道与脑损伤相关的miR-221-3p进行后续研究。RT-qPCR证实SAH大鼠海马组织中miR-221-3p表达升高。双荧光素酶报告基因实验证实miR-221-3p可与LYVE1 mRNA的3'-UTR结合并抑制其表达。共培养实验发现，miR-221-3p可能通过外泌体从原代海马神经元传递至巨噬细胞，从而调控LYVE1表达。

miR-221-3p-Mediated Reduction of LYVE1 Exacerbates EBI in SAH Rats

抑制miR-221-3p可上调LYVE1表达，改善神经功能评分，减轻脑水肿，降低病理评分，减少脑出血和BBB通透性，减轻神经元损伤和凋亡，增加LYVE1⁺CD68⁺巨噬细胞数量，促进VEGF-A表达和血管新生。而敲低LYVE1可逆转这些保护作用。

circ_0004058 Competitively Binds to miR-221-3p and Upregulates LYVE1 Expression, Thus Attenuating EBI in SAH Rats

通过circBank数据库预测miR-221-3p的上游circRNAs，并与GSE161913数据集中的差异表达circRNAs取交集，获得两个候选circRNAs：circ_0000826和circ_0004058。由于circ_0004058在SAH组中显著下调（p=0.03），符合circRNAs与miRNAs的典型调控模式，故选择circ_000405进行后续研究。RNase R消化实验证实circ_0004058具有环状结构稳定性，RT-qPCR显示SAH大鼠脑组织和rBMECs中circ_0004058表达降低。双荧光素酶报告基因实验、RNA pull-down、RIP和FISH实验均证实circ_0004058可与miR-221-3p直接结合。共培养实验发现，circ_0004058可能通过外泌体调控巨噬细胞中miR-221-3p和LYVE1的表达。过表达circ_0004058可抑制miR-221-3p表达，上调LYVE1，改善神经功能，减轻脑水肿和病理损伤，减少脑出血和BBB破坏，抑制神经元损伤和凋亡，增加LYVE1⁺CD68⁺巨噬细胞数量，促进血管新生。而过表达miR-221-3p可逆转这些保护作用。同时，敲低LYVE1也可逆转circ_0004058过表达带来的保护效应。

LYVE1⁺CD68⁺ Macrophages Alleviate EBI and Promote Angiogenesis in SAH Rats

使用抗CSF1R抗体抑制巨噬细胞活性后，LYVE1过表达带来的神经功能改善、脑水肿减轻、病理评分降低、脑出血减少、BBB完整性改善、神经元损伤和凋亡减轻、LYVE1⁺CD68⁺巨噬细胞数量增加以及血管新生促进等效应均被逆转。

本研究首次揭示了circ_0004058通过调控miR-221-3p/LYVE1轴在SAH诱导的EBI中发挥保护作用。具体而言，circ_0004058作为ceRNA竞争性结合miR-221-3p，解除其对LYVE1的抑制，从而增加LYVE1⁺CD68⁺巨噬细胞数量，促进血管新生，减轻EBI。这一发现不仅为理解SAH后EBI的分子机制提供了新的视角，也为开发针对SAH的新型治疗策略提供了潜在靶点。

研究的创新性在于首次揭示了circ_0004058在SAH中的保护作用，并阐明了其通过miR-221-3p/LYVE1轴调控巨噬细胞介导的血管新生的具体机制。与以往研究相比，本研究不仅证实了miR-221-3p在脑损伤中的作用，还进一步明确了其通过下调LYVE1加重脑损伤的具体途径，并发现了circ_0004058作为上游调控分子的新功能。

尽管本研究取得了重要发现，但仍存在一些局限性：样本量虽能满足统计学要求，但可能限制结果的普适性；SAH大鼠模型不能完全模拟人类SAH的复杂性；研究仅使用雄性大鼠，未评估性别特异性差异；可能存在其他miRNA介导的通路参与EBI过程。未来研究可通过扩大样本量、采用更临床相关的模型、探索其他信号通路以及开展人体组织验证来进一步完善该领域的研究。

总之，本研究证实了circ_0004058/miR-221-3p/LYVE1调控轴在SAH后EBI中的重要作用，为SAH的治疗提供了新的潜在靶点和策略。这些发现不仅具有重要的理论意义，也为未来开发针对SAH的精准医疗方案奠定了坚实的基础。