膜吸附器与树脂在生物制药过程中高效清除宿主细胞蛋白的比较研究

　　本刊推荐：为解决生物制药下游纯化中宿主细胞蛋白(HCP)难以高效清除的问题，研究人员开展阴离子交换介质（包括膜吸附器和树脂）在单克隆抗体(mAb)纯化中的比较研究。结果表明，膜吸附技术（特别是3M? Polisher ST）能显著降低HCP水平（从8000 ppm降至10 ppm），且对聚山梨酯降解酶（酯酶）有良好清除效果。该研究为优化生物制药纯化工艺提供了重要依据，对提升产品质量和安全性具有重要意义。

　　

在生物制药领域，单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)已经成为治疗多种疾病的重要武器。然而，在生产这些精密药物的过程中，一个令人头疼的问题始终存在——如何有效地清除宿主细胞蛋白(host cell protein, HCP)。这些由生产细胞产生的杂质蛋白不仅会影响药物的纯度，更令人担忧的是，其中一些酶类（如酯酶）即使在极低浓度下也能降解制剂中的聚山梨酯(polysorbate, PS)表面活性剂，从而影响药物的稳定性和安全性。

传统的纯化工艺主要依赖基于树脂的色谱技术，但随着生物制药行业对效率和生产成本的要求不断提高，膜吸附器(membrane adsorber)技术应运而生。这种新型技术号称能够提供更高的流速、更短的处理时间，且无需复杂的树脂填充和清洁验证过程。然而，这两种技术在实际生产中的表现究竟孰优孰劣？它们对关键杂质（特别是那些能够降解聚山梨酯的酶类）的清除效果如何？这些问题仍然需要深入的科学研究来回答。

来自斯洛文尼亚卢布尔雅那大学药学院的Ernest ?prager等研究人员在《Journal of Chromatography B》上发表了一项精彩的研究，他们系统地比较了三种阴离子交换色谱(anion exchange chromatography, AEC)介质在mAb纯化过程中的表现。研究团队不仅关注传统的HCP清除效果，还特别追踪了那些"麻烦制造者"——聚山梨酯降解酶的清除情况，为生物制药工艺开发提供了宝贵的见解。

研究人员采用了多种关键技术方法开展本研究。他们运用实验设计(Design of Experiments, DoE)方法系统评估了pH、离子强度和上样密度对杂质去除的影响；采用动力学结合容量(dynamic binding capacity, DBC₁₀)测定评估不同介质的结合性能；通过尺寸排阻色谱(size-exclusion chromatography, SEC)分析蛋白质聚集情况；建立荧光酯酶活性检测方法监测聚山梨酯降解酶的清除效果；利用液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)技术深入分析HCP组成；并进行聚山梨酯稳定性研究评估最终产品的稳定性。所有实验均使用CHO细胞培养产生的mAb蛋白A层析洗脱液作为研究材料。

3.1. 纯化工艺描述与研究设计

研究人员设计了一个具有挑战性的研究体系，使用含有高水平HCP和聚集体的mAb溶液，该溶液在蛋白A捕获后经过病毒灭活(viral inactivation, VIN)处理，还表现出导致聚山梨酯降解的趋势。研究中比较了基于膜的混合纯化（使用Polisher ST，结合过滤和AEC抛光）、膜吸附器（Sartobind Q）和传统AEC树脂（Q Sepharose FF）的性能。所有AEC步骤均采用流穿模式操作，直接放置在VIN步骤之后，阳离子交换色谱(cation exchange chromatography, CEC)之前，以最大限度地减少稀释步骤并保持料液电导率。

3.2. 与BSA的动力学结合容量研究

研究人员首先使用模型蛋白牛血清 albumin (bovine serum albumin, BSA)评估了三种色谱介质的动力学结合容量。结果显示，BSA与带正电荷配基之间的相互作用是静电性质的，较高的盐浓度导致结合降低，较高的pH值则增加结合容量。Polisher ST表现出更好的耐盐性，这归因于其胍基功能化聚酰胺膜的特性。所有三种色谱介质每体积单位的动态结合容量相当，为后续研究设合理的上样密度范围。

3.3. 杂质去除特性的实验设计方法

研究人员通过三参数DoE研究评估了上样密度、上样pH和上样电导率对杂质去除和工艺性能的影响。研究发现Polisher ST对HCP的去除表现出pH不依赖性，而电导率的增加与去除能力下降相关。Sartobind Q的表现符合预期，较高的pH水平改善了HCP去除效果，而较高的电导率导致去除效果下降。Q Sepharose FF则显示出意外的混合模式样行为，HCP去除与电导率的关系呈U型曲线，最佳点取决于工艺pH值。

3.4. 酯酶去除筛选

尽管所有三种测试的色谱介质都能有效降低总HCP水平达2个对数减少值(log₁₀ reduction value, LRV)，但高风险HCP（如残留酯酶）即使在亚ppm水平也能降解mAb制剂中的聚山梨酯。研究人员采用基于脂肪酸酯和4-甲基伞形酮底物的荧光高通量测定来量化残留酯酶活性。研究发现，酯酶去除与总HCP水平相关性较弱，表明仅依靠总HCP ELISA测量可能误导对残留酶活性的预测。

3.5. HCP富集体在抛光过程中的行为

研究发现HCP和聚集体去除表现出相似的个体趋势，表明HCPs可能富集在聚集体分中。SEC-UPLC分析显示，早期洗脱的聚集体（early HMWs）有显著减少，特别是使用Polisher ST或Sartobind Q时。制备级SEC分离证实HCPs在聚集体分中富集，单体mAb分仅包含总HCP质量的5%，而大部分与早期HMWs和主要HMWs分共同洗脱。

3.6. LC-MS/MS HCP分析

通过LC-MS/MS蛋白质组学分析发现，SEC分中不同HCP的数量与ELISA测定的总HCP浓度密切相关。在主要峰分中鉴定到的五个HCP在聚集体分中也都能检测到。比较HCP物理化学性质发现，分之间在理论蛋白质分子量、等电点或疏水性值方面没有显著差异，无法解释它们的分布情况。

3.7. 料液稳健性评估

为了更好地了解上样阶段聚集体和HCP去除的趋势，研究人员在色谱出口位置监测每种杂质，进行了穿透实验。研究发现，所有设备的聚集体和HCP去除都很匹配，并遵循相似的趋势。Polisher ST更有效地去除了HCP，最初HCP水平显著低于Sartobind Q或Q Sepharose FF。

3.8. 两步色谱工艺

研究表明，Polisher ST可以有效地耦合深度过滤和AEC抛光步骤，简化纯化过程并提高生产率。然而，捕获后VIN中间体中相对较高的HCP和聚集体含量使得仅依靠一种类型的离子交换色谱无法实现高mAb产品纯度。至少需要两个正交步骤才能实现足够的产品纯度。

这项研究通过多层次的分析方法，揭示了不同AEC介质在mAb纯化中的性能特点。研究结果表明，膜吸附器技术（特别是Polisher ST）在HCP清除方面表现出色，能够将HCP水平从8000 ppm显著降低至10 ppm，且对聚山梨酯降解酶有良好的清除效果。

更重要的是，研究发现HCPs倾向于富集在mAb聚集体分中，而这种富集现象影响了它们在纯化过程中的清除效率。基于膜的设备由于其对流质量传输机制和开放的孔结构，能够更有效地结合大型物种（包括HCP富集体），这可能解释了为什么膜吸附器在HCP清除方面优于传统树脂。

研究还强调了一个关键点：总HCP水平不能完全反映关键HCP（如聚山梨酯降解酶）的清除情况。因此，在工艺开发过程中，需要结合多种正交的分析方法（如酶活性测定）来全面评估纯化效果。

从实际应用角度来看，Polisher ST作为混合纯化器，能够同时去除可溶性和不溶性污染物，将深度过滤和AEC抛光步骤合二为一，显著简化了纯化工艺并提高了生产效率。然而，研究也指出，对于具有高HCP和聚集体含量的挑战性料液，仅依靠一种类型的离子交换色谱可能不足以实现所需的产品纯度，需要多个正交步骤的组合。

这项研究不仅为生物制药行业提供了关于不同AEC介质性能的详细数据，还为工艺开发和优化提供了实用的指导。特别是在应对具有挑战性的料液和确保清除关键HCP（如聚山梨酯降解酶）方面，这些发现具有重要的实际应用价值。随着生物制药行业对产品质量和生产效率要求的不断提高，这类深入比较研究将为技术创新和工艺优化提供坚实的科学基础。