PFKM通过调控RAB8B介导的外泌体释放促进肺腺癌化疗耐药性的机制研究

　　本研究针对肺腺癌化疗耐药性难题，发现糖酵解关键限速酶PFKM通过调控RAB8B表达影响外泌体释放，进而调节细胞凋亡和糖酵解代谢的新型机制。研究人员通过靶向代谢组学、蛋白质组学和多组学验证，揭示PFKM-RAB8B轴可作为逆转LUAD化疗耐药的新靶点，为临床克服化疗耐药提供了重要理论依据。

　　

肺腺癌(LUAD)作为非小细胞肺癌(NSCLC)中最常见的亚型，约占所有肺癌病例的40%-45%，已成为癌症相关死亡的主要原因之一。其早期诊断率低、肿瘤细胞高度异质性以及耐药性的产生，导致晚期LUAD患者的五年生存率不足15%。以顺铂为基础的辅助化疗是晚期LUAD的标准治疗方案，但化疗效果常因耐药性的出现而大打折扣。因此，深入探究LUAD化疗耐药性的分子机制，对于开发新的治疗策略至关重要。

肿瘤细胞中常发生代谢重编程，其中糖酵解与耐药性密切相关。糖酵解通过提供能量、改变细胞内环境及激活关键信号通路，支持耐药相关蛋白的功能和表达，成为肿瘤细胞抵抗化疗的重要机制。靶向糖酵解代谢已成为克服耐药性的有前景策略。磷酸果糖激酶肌肉亚型(PFKM)作为糖酵解过程中的关键限速酶，催化果糖-6-磷酸(F6P)向果糖-1,6-二磷酸(FBP)的转化，其在多种癌症中表达上调。然而，PFKM在化疗耐药中的作用尚未被探索。

另一方面，外泌体作为源自晚期内体的膜结合囊泡，携带多种生物分子，在肿瘤耐药性、分子转移、肿瘤代谢和免疫逃逸中发挥关键作用。研究表明糖酵解代谢与外泌体之间存在潜在串扰，糖酵解关键酶通过非传统功能调节肿瘤细胞中外泌体的生物合成和分泌，而外泌体则通过重编程糖酵解代谢影响肿瘤进展和耐药性。

在这项发表于《Journal of Pharmaceutical Analysis》的研究中，中国药科大学的研究团队通过综合运用靶向代谢组学、蛋白质组学、分子生物学和功能实验等多种技术手段，深入探究了PFKM在肺腺癌化疗耐药中的作用机制。

研究人员首先通过逐步增加药物浓度结合高剂量冲击的方法构建了顺铂耐药细胞模型(A549/DDP和95-D/DDP)。利用自主研发的化学标记试剂Tmt-PP，建立了LC-MS/MS靶向代谢组学方法，实现了糖磷酸和羧酸代谢物的良好色谱分离、生物基质干扰减少和检测灵敏度增强。该方法所有分析物的校准曲线均表现出良好的线性关系，相关系数R²>0.99，日内和日间精密度CV均小于20%，回收率超过85%，基质效应评估显示斜率比在90%-120%之间，表明所有分析物几乎不受生物效应影响。

研究发现耐药细胞中多种糖酵解代谢物显著上调，特别是反映PFKM活性的FBP/F6P比值显著升高。Western blot分析显示PFKM在耐药细胞中表达显著上调，且与LUAD患者不良预后正相关。通过慢病毒转导建立PFKM敲降(PFKM-KD)和过表达(PFKM-OE)细胞系，发现PFKM-KD能显著增强 cisplatin敏感性，促进细胞凋亡，而PFKM-OE则降低敏感性。在患者来源的LUAD类器官模型中进一步验证了PFKM对 cisplatin耐药性的促进作用。

研究人员采用差速离心法分离外泌体，通过透射电镜(TEM)、Western blot和纳米颗粒跟踪分析(NTA)等技术对外泌体进行表征。发现耐药细胞外泌体释放显著增加，且来自耐药细胞的外泌体能够增强敏感细胞的化疗耐药性。靶向代谢组学分析显示耐药细胞来源的外泌体具有增强的糖酵解代谢，FBP/F6P比值显著上调。

通过蛋白质组学分析，研究人员发现RAB8B是PFKM调控的下游关键蛋白。Western blot验证表明PFKM通过溶酶体途径调控RAB8B降解，而不影响其mRNA水平。使用溶酶体抑制剂BafA1处理可逆转PFKM-KD引起的RAB8B下调，而蛋白酶体抑制剂MG132无显著影响。功能实验表明RAB8B-KD能逆转PFKM-OE增强的外泌体释放和化疗耐药性，且RAB8B高表达与LUAD患者不良预后相关。

进一步研究发现，PFKM-OE细胞来源的外泌体具有更高的糖酵解代谢水平，而PFKM-KD细胞来源的外泌体则显示降低的糖酵解代谢。当敏感细胞与PFKM-OE细胞来源的外泌体共培养时，其糖酵解代谢显著增强，FBP/F6P比值上升；而与PFKM-KD细胞来源的外泌体共培养则出现相反效应。

研究结果表明，PFKM通过调控RAB8B表达影响外泌体释放，进而调节细胞凋亡和糖酵解代谢，从而促进化疗耐药。耐药细胞通过释放具有增强糖酵解活性的外泌体，增强敏感细胞的化疗耐药性。这一发现揭示了外泌体-糖酵解串扰调控LUAD化疗耐药的新机制，PFKM-RAB8B轴可能作为缓解LUAD化疗耐药潜力的治疗靶点。

该研究的创新之处在于首次揭示了PFKM通过调控RAB8B介导的外泌体释放来促进肺腺癌化疗耐药性的新机制，为理解肿瘤代谢与细胞间通讯的相互作用提供了新视角。研究结果不仅为LUAD化疗耐药性的临床诊断提供了潜在的生物标志物(FBP/F6P比值)，也为开发针对PFKM-RAB8B轴的新型治疗策略奠定了理论基础。尽管PFKM与临床预后的相关性仍需进一步验证，且PFKM调控RAB8B促进外泌体释放的具体分子机制需要更多研究，但本研究无疑为克服肺腺癌化疗耐药性提供了重要的科学依据和新的研究方向。