整合高分辨生物活性分析与亲和配体垂钓技术揭示芍药中没食子酰衍生物作为新型儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂

　　本研究针对帕金森病治疗中COMT抑制剂的生物利用度低和肝毒性问题，开发了整合高分辨生物活性分析（HRBP）与亲和配体垂钓的创新平台，成功从芍药中鉴定出16种新型COMT抑制剂，其中没食子酰芍药苷（IC50=16.2±3.4μM）和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖（IC50=3.1±0.5μM）活性显著，分子对接揭示了关键结合机制，为植物源酶抑制剂发现提供了高效方法。

　　

在帕金森病(Parkinson's disease, PD)的治疗策略中，儿茶酚-O-甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase, COMT)抑制一直扮演着关键角色。这种酶负责多巴胺的代谢降解，其活性直接影响大脑中多巴胺的水平。目前临床使用的合成COMT抑制剂如托卡朋(tolcapone)和恩他卡朋(entacapone)虽然有效，却面临着肝毒性和生物利用度低的双重挑战，这促使科研人员不断寻找更安全的天然替代品。

芍药(Paeonia lactiflora Pall.)作为传统中药，在治疗脑缺血、癫痫和退行性脑疾病方面有着悠久历史。统计分析显示，在治疗帕金森病的中药方剂中，芍药是使用频率最高的核心药材，在分析的处方中占比高达50%。尤其引人注目的是，芍药中的儿茶素衍生物结构与COMT底物相似，提示其可能通过竞争性结合发挥抑制作用。然而，尽管前景看好，针对芍药中特定活性成分尤其是其抗COMT活性的研究仍然有限。

面对传统草药中复杂的植物化学成分，精确鉴定生物活性成分并系统阐明其药效基础成为植物药理学研究的关键挑战。近年来，基于亲和性的筛选技术如磁珠配体垂钓和亲和选择质谱技术已经彻底改变了生物活性化合物的发现方式。然而，这些方法都受到基质干扰和潜在假阳性/假阴性结果的限制。作为补充，高分辨生物活性分析(High-resolution bioassay profiling, HRBP)平台整合了液相色谱分离、基于纳米分馏的实时生物活性评估和基于质谱/核磁共振的结构鉴定，能够快速筛选复杂基质中的生物活性成分。

在这项发表于《Journal of Pharmaceutical Analysis》的研究中，Jiaming YUAN等研究人员开发了一种结合亲和配体垂钓与HRBP平台的综合筛选策略，系统性地从芍药中发掘COMT抑制剂。研究团队采用了三重策略：首先开发了使用COMT固定化磁珠(COMT@MBs)的亲和配体捕获系统，随后进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)结构解析；其次构建了结合纳米分馏、荧光抑制实验和代谢物注释的活性筛选流程；最后通过酶促IC₅₀测定和分子对接模拟对活性化合物进行机制验证。

关键技术方法包括：使用羧基终止磁珠制备COMT固定化磁珠并通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记进行表征；采用大鼠肝脏S9作为酶源进行COMT活性测定；通过半制备液相色谱对芍药提取物进行分级；建立整合高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(HPLC-Q-TOF-MS/MS)的HRBP平台进行活性成分筛选；利用AutoDock Vina进行分子对接分析。

研究结果部分显示：

3.1. COMT@MBs的制备及COMT固定化和洗脱条件的优化

通过FT-IR和FITC荧光标记成功验证了COMT在磁珠上的固定化。优化结果表明pH5.0为酶活性的最佳条件，COMT加载量为100μg/mg磁珠，孵育时间24小时，室温(25°C)为适宜孵育温度。60%甲醇/水(v/v)系统显示出最高的洗脱效率。

3.2. COMT@MB基配体垂钓系统的性能评估

使用模型混合物A(含schizandrin、morin和tolcapone)评估系统性能，结果显示COMT@MBs能有效捕获阳性化合物(morin和tolcapone)，而对阴性对照(schizandrin)吸附极少，证明其在复杂样品中进行亲和配体垂钓的有效性。

3.3. HRBP平台的优化和性能评估

系统优化了酶和底物(DHMC)浓度，确定最佳条件为20μM DHMC、0.5mg/mL大鼠肝脏S9。测得K_m值为1.7±0.5μM，与文献报道一致。阳性对照morin和tolcapone的IC₅₀值分别为10.1±0.7μM和80.0±13.9nM。

3.4. 使用COMT@MB基配体垂钓系统从芍药提取物中筛选COMT抑制剂

芍药水提取物对COMT表现出强抑制效应，半数抑制率浓度为7.8μg/mL。通过配体垂钓共检测到21个潜在亲和化合物，其中鞣质类成分最为丰富(18个化合物)。

3.5. 使用HRBP平台从芍药提取物中筛选COMT抑制剂

通过HRBP平台在粗提物中观察到至少10个负峰，经半制备LC分级后重新筛选，在F1、F2和F6三个主要馏分中共发现16个明显的负峰，表明这些成分具有COMT抑制活性。

3.6. 双重筛选结果的质谱分析

通过HPLC-Q-TOF-MS/MS分析，从配体垂钓中鉴定出21个潜在活性成分，主要为鞣质类；从HRBP中鉴定出15个潜在活性成分，包括11个鞣质、1个有机酸(柠檬酸)和1个黄烷醇化合物(儿茶素)。两种方法共同鉴定出的成分包括没食子酸、双没食子酸、儿茶素、没食子酰芍药苷和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖。

3.7. 体外IC₅₀测试和分子对接分析

活性验证显示没食子酰芍药苷和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖对COMT有显著抑制效果，IC₅₀值分别为16.2±3.4μM和3.1±0.5μM。分子对接分析表明，这些没食子酸酯衍生物主要通过氢键和疏水相互作用与COMT结合，结合位点与硝基儿茶酚药物托卡朋相似。

研究结论表明，该研究成功开发了整合HRBP和配体垂钓的创新平台，系统性地解密了芍药的抗帕金森病物质基础。研究发现没食子酰芍药苷和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖作为新型COMT抑制剂具有强效活性，并确立了没食子酰化作为关键的药效团决定因素。这些没食子酰基通过氢键和疏水相互作用在催化口袋稳定抑制剂-COMT复合物。该综合平台克服了传统植物化学筛选的局限性，实现了靶标特异性发现。这项工作不仅验证了芍药在帕金森病管理中的民族药理学应用，而且确立了没食子酰酯作为植物药物开发的新型支架。研究发现架起了传统神经保护应用与现代分子药理学之间的桥梁，为机制驱动的草药重新发现提供了模板。