PPARγ通过调控Th17极化及CEBPA/IL-17C信号轴促进口腔鳞癌进展的机制研究

　　本研究针对口腔鳞癌（OSCC）免疫抑制微环境形成机制不明的问题，聚焦PPARγ在肿瘤免疫调控中的作用。研究人员通过体内外实验发现，抑制PPARγ可显著抑制OSCC进展，并揭示其通过转录激活CEBPA促进IL-17C表达，进而驱动Th17细胞分化的新机制。该研究为OSCC免疫治疗提供了新的靶点和理论依据，具有重要的临床转化价值。

　　

口腔鳞状细胞癌（OSCC）作为头颈部最常见的恶性肿瘤，其治疗尤其是晚期患者的治疗效果仍不理想，五年生存率仅约60%。尽管免疫检查点抑制剂（ICIs）的出现为肿瘤治疗带来了变革，但在OSCC中的疗效有限，这主要归因于肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性。TME中充满了各种非免疫细胞、免疫细胞、细胞因子和代谢产物，它们之间的复杂相互作用深刻影响着免疫抑制和肿瘤进展。其中，辅助性T细胞17（Th17细胞）在多种癌症中被证实可通过分泌白细胞介素17A（IL-17A）等细胞因子促进血管生成、炎症和免疫逃逸。然而，Th17细胞在OSCC微环境中的具体功能及其极化的上游调控机制尚不完全清楚。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是核受体超家族成员，在代谢、细胞增殖分化和癌症中发挥多效性作用。先前有研究表明PPARγ在头颈部鳞癌（HNSCC）中高表达且与患者预后不良相关，但其在塑造OSCC免疫抑制微环境中的具体功能尚未明确。为了探索PPARγ在调节TME及其对OSCC进展的影响，研究人员开展了此项研究，论文发表在《Journal of Cancer Research and Clinical Oncology》。

为开展研究，作者主要应用了以下关键技术方法：利用4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）诱导的小鼠OSCC模型并通过免疫组化（IHC）验证PPARγ过表达；采用批量RNA测序（RNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析解析PPARγ驱动的促瘤机制；通过体外共培养OSCC细胞与CD4⁺T细胞，以及体内皮下移植瘤模型，研究PPARγ对Th17细胞分化的影响；运用Cut&Run技术检测CEBPA与IL-17C启动子的结合；通过多色免疫荧光（mIHC）对104例OSCC患者组织芯片进行蛋白表达与定位分析。

研究结果

抑制PPARγ可在体内外抑制OSCC的进展

Western blot分析显示，与正常小鼠舌上皮细胞相比，OSCC细胞系SCC-7中PPARγ蛋白表达显著上调。通过4NQO饮水法构建的小鼠OSCC模型也证实，癌组织中PPARγ表达水平显著高于正常组织。使用PPARγ的选择性小分子拮抗剂GW9662处理SCC-7细胞，CCK-8实验表明抑制PPARγ可显著抑制细胞增殖。在C3H/HeJ小鼠皮下移植瘤模型中，GW9662治疗显著抑制了肿瘤生长，且未引起明显的体重下降或全身毒性迹象，表明其具有良好的体内耐受性。GW9662治疗组小鼠在成瘤后也表现出更好的预后。这些结果支持抑制PPARγ能有效抑制OSCC的发生和发展。

PPARγ通过调节IL-17信号通路调控OSCC的发展

对经GW9662处理的UM1细胞进行RNA-seq分析，差异表达基因分析显示，与DMSO对照组相比，GW9662处理组有236个基因上调，471个基因下调，其中包括IL-17信号通路的关键分子IL-17C。KEGG通路富集分析显示，下调基因显著富集于免疫相关信号通路，尤其是IL-17通路。基因集富集分析（GSEA）进一步发现，抑制PPARγ负向调控了T细胞趋化、Th17型免疫应答调节和中性粒细胞趋化等免疫相关功能。对公共scRNA-seq数据集（GSE172577）的分析表明，PPARG（PPARγ的基因名）的表达主要局限于上皮细胞。PPARG阳性的上皮细胞显著上调了与脂质代谢、上皮分化以及PPAR信号通路、IL-17信号、TGF-β信号和Th17分化相关的基因，提示PPARγ在上皮细胞中积极调控IL-17通路，可能增强Th17细胞的活化。

PPARγ通过调控IL-17C促进Th17细胞分化

从小鼠脾脏分离CD4⁺T细胞（纯度约84%）后，将其与SCC-7细胞在Th17极化条件下共培养。流式细胞术分析显示，药理抑制PPARγ降低了Th17细胞的比例。对共培养上清液的ELISA检测也表明，抑制PPARγ显著减少了Th17特征性细胞因子IL-17A的分泌。测序分析显示GW9662处理下调了IL-17通路相关基因（包括IL-17C）的表达，qPCR和Western blot证实抑制PPARγ显著降低了SCC-7细胞中IL-17C的mRNA和蛋白水平。在Th17极化条件下，用重组IL-17C（rIL-17C）刺激可显著增加Th17细胞频率，而联合使用中和性抗IL-17C抗体则能逆转此效应。这些发现表明PPARγ通过调节IL-17C在促进Th17细胞定向分化和细胞因子产生中起关键作用。

PPARγ通过CEBPA的转录调控促进IL-17C的表达

通过整合分析GeneCards数据库，筛选出11个PPARγ的潜在下游靶点与291个IL-17C的预测转录因子，发现CCAAT/增强子结合蛋白α（CEBPA）是唯一重叠的蛋白。在SCC-7细胞中，GW9662处理显著降低了Cebpa的mRNA和CEBPA的蛋白水平，支持PPARγ通过转录激活CEBPA促进IL-17C表达的假说。AlphaFold3预测了CEBPA与IL-17C启动子的结合，JASPAR数据库分析也揭示了IL-17C启动子区域内存在保守的CEBPA结合基序（CAAT盒）。随后，沉默CEBPA显著降低了IL-17C的mRNA和蛋白表达。Cut&Run实验及后续的qPCR分析证实，CEBPA能特异性富集在IL-17C启动子的预测结合位点。功能上，流式细胞术显示敲低CEBPA显著降低了Th17细胞的比例。这些结果揭示PPARγ通过转录激活CEBPA来促进IL-17C表达，从而建立了一条PPARγ-CEBPA-IL-17C调控轴，该轴有助于OSCC中Th17细胞分化和肿瘤相关炎症。

靶向PPARγ在体内通过CEBPA依赖的IL-17C/IL-17A通路抑制Th17极化

在C3H/HeJ小鼠皮下移植瘤模型中，GW9662治疗组肿瘤内Th17细胞（CD4⁺ IL-17A⁺）极化受到显著抑制。与体外结果一致，抑制PPARγ显著降低了肿瘤组织中CEBPA、IL-17C和IL-17A的mRNA和蛋白水平。在更接近天然口腔肿瘤微环境的4NQO诱导的OSCC组织中，多色免疫荧光（mIHC）染色显示，与正常口腔黏膜相比，OSCC病变中IL-17C、CEBPA和IL-17A蛋白水平显著升高。这些发现共同表明，体内抑制PPARγ通过下调CEBPA和IL-17C来抑制Th17细胞分化，从而破坏了OSCC TME中的免疫调节轴。

PPARγ/CEBPA/IL-17C轴与OSCC患者生存相关

对104对OSCC肿瘤标本进行mIHC分析，结果显示IL-17C、CEBPA和IL-17A在OSCC组织中高表达。定量相关性分析显示，PPARγ水平与IL-17C、CEBPA和IL-17A的表达呈强正相关，且IL-17C水平与CEBPA和IL-17A表达紧密相关，证实了协调调控级联的存在。Kaplan-Meier生存分析表明，IL-17C、CEBPA和IL-17A的高表达均与患者总生存期较差显著相关。这些结果为PPARγ/CEBPA/IL-17C/IL-17A轴在OSCC中的存在提供了坚实的组织学验证，并突出了其在肿瘤免疫微环境中的潜在预后和功能相关性。

结论与讨论

本研究揭示了一种OSCC中新的免疫调节机制，即PPARγ通过PPARγ/CEBPA/IL-17C轴促进Th17细胞分化。通过抑制PPARγ破坏该信号轴，为重塑肿瘤免疫微环境和抑制恶性进展提供了一种引人注目的策略。这些发现为了解PPARγ的致癌作用提供了关键的机制见解，并为开发针对OSCC中肿瘤-免疫相互作用的免疫调节疗法指明了新方向。尽管Th17细胞在肿瘤进展中的作用存在争议，但近期研究一致强调了其促瘤效应。Th17细胞可分泌IL-17A、IL-22、IL-23等因子，在TME中促进血管存活、招募中性粒细胞并激活免疫抑制活动，从而促进肿瘤进展。本研究发现在OSCC中PPARγ的异常高表达促进了Th17细胞分化，重塑了免疫微环境，并驱动OSCC进展，表明PPARγ可能通过促进Th17介导的炎症来发挥其在OSCC中的致癌功能。CEBPA作为一种参与髓系细胞分化、免疫细胞发育和炎症信号的转录因子，被确定为PPARγ下游的关键中介分子。多组学整合分析及实验验证表明，PPARγ促进CEBPA表达，进而激活IL-17C的转录，IL-17C随后促进Th17分化。从转化医学的角度看，靶向PPARγ代表了一种有前景的策略，可破坏Th17介导的免疫抑制，并可能对现有的免疫疗法起到补充作用。然而，尽管本研究及先前工作支持PPARγ抑制的免疫调节潜力，但GW9662的转化应用性尚未完全确立。未来工作需要评估其剂量依赖性安全性、药代动力学特性，以及在与免疫检查点抑制剂（如抗PD-L1/PD-1）联用时在临床相关OSCC模型中的治疗协同效应。