亚抑菌浓度抗生素下优先病原体的蛋白质组与代谢组响应机制研究

　　本刊推荐：为揭示抗生素耐药性早期机制，研究人员开展亚抑菌浓度抗生素作用下四种优先病原体的多组学研究，发现三甲胺代谢通路普遍响应、氯霉素诱导翻译应激与氧化应激调控网络、万古霉素抑制全局代谢调控因子CodY/CcpA等关键机制，为靶向耐药性进化过程提供新视角。

　　

抗生素的发现与应用曾是现代医学的重大突破，拯救了无数生命，然而随着抗生素滥用问题日益严重，细菌耐药性进化已成为全球公共卫生领域的重大挑战。世界卫生组织数据显示，抗生素耐药菌每年导致约70万人死亡，预计到2050年可能超过千万。医院感染中多重耐药菌的流行尤为棘手，其中碳青霉烯类或第三代头孢菌素耐药的肠杆菌科（如肺炎克雷氏菌Klebsiella pneumoniae和大肠杆菌Escherichia coli）以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）等革兰氏阳性菌被列为“优先病原体”。尽管研究人员对高浓度抗生素的杀菌机制及遗传耐药突变已有较多了解，但环境中普遍存在的亚抑菌浓度（sub-MIC）抗生素如何驱动细菌适应性响应和耐药进化，仍是未被充分探索的关键科学问题。

为系统解析细菌在亚抑菌浓度抗生素压力下的早期应答机制，由Monika Subanovic、Dean Frawley、Ciara Tierney、Trinidad Velasco-Torrijos和Fiona Walsh组成的研究团队，采用整合蛋白质组学与代谢组学的策略，对大肠杆菌MG1655、肺炎克雷氏菌NCTC418、粪肠球菌NCTC13169和金黄色葡萄球菌NCTC8325这四种模式病原体在多种抗生素亚抑菌浓度处理下的分子响应网络进行了深度解析。该研究近日发表于《npj Antimicrobials and Resistance》，为理解抗生素耐受性产生的早期机制提供了重要见解。

研究团队首先通过微量肉汤稀释法测定各菌株对特定抗生素的最小抑菌浓度（MIC），随后在0.5×MIC条件下处理对数生长期的细菌1小时，分别提取胞内与胞外代谢物进行核磁共振（¹H NMR）非靶向代谢组学分析，同时通过液相色谱－质谱（LC-MS/MS）进行蛋白质组定量分析。数据采用主成分分析（PCA）、差异表达蛋白（DAPs）筛选、基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析、蛋白质互作（PPI）网络构建等生物信息学方法进行系统整合。

研究首先发现亚抑菌浓度抗生素对蛋白质组的影响存在菌种特异性：革兰氏阴性菌（大肠杆菌和肺炎克雷氏菌）蛋白质组响应较弱，而革兰氏阳性菌（粪肠球菌和金黄色葡萄球菌）则表现出强烈的蛋白质组重编程。代谢组响应则普遍显著，且胞外代谢物改变数量平均为胞内的1.2–2.1倍。

在革兰氏阴性菌中，环丙沙星显著诱导了SOS响应蛋白（如RecA、UvrA、UvrD）的上调；肺炎克雷氏菌中与环丙沙星耐药相关的DNA旋转酶抑制剂SbmC（与大肠杆菌GyrI 64%同源）丰度上升；亚胺培南处理引起分子伴侣和氧化应激相关蛋白（如热休克蛋白、过氧化氢酶）上调，而运动相关蛋白下调。

值得注意的是，所有受试菌种均出现三甲胺（TMA）代谢通路的改变，包括三甲胺N-氧化物（TMAO）、甲胺等代谢物浓度的显著变化，这一发现尚未在前述病原菌的抗生素响应机制中被报道。

针对革兰氏阳性菌，研究重点解析了氯霉素和万古霉素的调控机制。

在粪肠球菌NCTC13169中，氯霉素引发183个蛋白质丰度改变。功能富集显示与翻译过程、核糖体组装、细胞分裂相关蛋白（如DivIVA、GpsB）发生显著变化。芳香族氨基酸代谢酶（如预苯酸脱水酶、分支酸变位酶）上调，可能与应激保护性代谢重构有关。氧化应激调控蛋白SpxA及其靶基因（如GreA、MsrA/B）也被激活。代谢组数据表明氧化应激指示分子谷胱甘肽上升、次黄嘌呤下降，同时胞内外甘氨酸、TMAO、肉碱等代谢物改变，提示渗透保护与氮源代谢重定向可能协助细菌应对氯霉素压力。

在金黄色葡萄球菌NCTC8325中，氯霉素影响98个蛋白质，万古霉素则导致270个蛋白质下调。氯霉素主要扰乱翻译过程（核糖体 hibernation 促进因子HPF下调）、蛋白质折叠（肽酰脯氨酰异构酶PpiB下降可能影响毒力因子分泌）、氧化应激平衡（过氧化氢酶KatA、超氧化物歧化酶SodA/M、多种硫氧还蛋白下调）以及生物膜形成相关蛋白（如免疫显性抗原IsaA上调、自诱导分子合成酶LuxS下调）。差异代谢物中，甘氨酸、肌酸、TMAO等变化进一步印证代谢重编程的发生。

尤为重要的是，万古霉素处理显着抑制金黄色葡萄球菌的中心代谢通路。全局转录调控因子CodY、CcpA及LytR的丰度下降，导致糖酵解、TCA循环、嘌呤代谢、细胞壁合成（如D-丙氨酸代谢相关酶Alr1、Ddl）等关键通路广泛抑制。代谢组数据显示胞外葡萄糖、乙酸、琥珀酸下降，胞内乳酸改变，与蛋白质组响应高度一致。这一结果表明细菌可能通过减缓生长代谢速率策略应对万古霉素压力。

此外，研究还发现多种可能与抗生素应激适应相关的分子事件：包括喹诺酮类诱导的SOS反应、β-内酰胺类引起的分子伴侣上调、氯霉素触发的甘氨酸裂解系统改变、以及多种菌中TMA代谢的协调响应。这些过程不仅涉及经典耐药基因的表达调控，还涵盖代谢适应、氧化应激管理、细胞壁修饰、毒力调节等全局性生理调整。

该研究的结论强调，细菌在亚抑菌浓度抗生素作用下采取高度多样且物种特异性的分子适应策略。共有的代谢重编程（如三甲胺代谢、甘氨酸代谢）和特异的调控通路改写（如金黄色葡萄球菌中CodY/CcpA介导的代谢抑制、粪肠球菌中MarR/SpxA介导的氧化应激管理）共同促进了细菌在抗生素压力下的生存。这些发现不仅深化了对细菌耐药性进化早期事件的理解，也为针对耐受性表型的新型抗菌策略开发提供了潜在靶点，例如针对三甲胺代谢酶系、硫氧还蛋白修复系统、甘氨酸裂解系统或全局转录调控网络的干预可能延缓耐药性发展。

综上所述，该研究通过整合多组学方法，在分子层面揭示了优先病原菌为应对亚抑菌浓度抗生素刺激而激活的复杂响应网络，为抗菌研究领域提供了新的理论基础和技术视角。