基于iPSC的软骨形成增强剂筛选平台开发及其在骨关节炎药物发现中的应用

　　本研究针对骨关节炎(OA)缺乏长期有效治疗方法的临床难题，开发了一种基于诱导多能干细胞(iPSC)的高通量筛选平台。研究人员通过分化获得iPSC来源的软骨粗细胞(iCPs)和神经嵴来源的间充质基质细胞(iNCC-MSCs)，在2% O2缺氧条件下培养14天，利用DMMB法检测糖胺聚糖(GAG)合成，成功筛选出毛喉素(forskolin)、芝麻素(sesamin)和黄芩苷(baicalin)三种能显著增强iPSC来源细胞软骨形成能力的天然小分子化合物，为DMOADs研发提供了新的筛选工具和候选分子。

　　

在全球范围内，骨关节炎(Osteoarthritis, OA)正影响着约5.95亿人，随着人口老龄化趋势加剧，这一数字还在持续攀升。这种使人衰弱的疾病以关节软骨的进行性降解和丧失为特征，伴随滑膜组织炎症、软骨下骨损伤和骨赘形成。目前临床上面临的巨大挑战是缺乏能够长期修复受损软骨和治疗OA的有效方法，现有的治疗方法多为对症治疗，无法改变疾病进程。

在这一背景下，诱导多多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)技术的出现为软骨修复带来了新的希望。iPSCs具有自我更新和分化为多种细胞类型的能力，包括那些通常需要通过侵入性手术才能获得的软骨细胞和间充质基质细胞(mesenchymal stromal cells, MSCs)。这使得iPSCs成为药物筛选平台的理想细胞来源，为开发疾病修饰性骨关节炎药物(disease modifying OA drugs, DMOADs)提供了新的机遇。

为了应对这一挑战，来自爱尔兰高威大学再生医学研究所的研究团队在《Osteoarthritis and Cartilage Open》上发表了他们的最新研究成果。他们开发了一种基于iPSC的筛选平台，用于识别能够增强软骨形成的小分子化合物，旨在为OA治疗提供新的候选药物。

研究人员采用了几项关键技术方法开展本研究：首先通过定向分化 protocol 从人iPSCs获得iCPs和iNCC-MSCs两种细胞类型；使用96孔V底板进行三维 pellet 培养，在2% O₂缺氧条件下培养14天；利用JANUS自动化液体处理工作站进行高通量小分子筛选；通过1,9-二甲基亚甲蓝(DMMB)法定量检测糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)合成作为主要读数方法；采用qPCR和免疫荧光染色对软骨相关基因和蛋白表达进行验证。研究还包括了来自人骨髓的原代MSCs(BM-MSCs)作为对照细胞系。

iPSCs的软骨形成潜力

研究团队成功通过定向分化方案生成了iCPs和iNCC-MSCs，并证实了这两种细胞类型都具有软骨形成潜力。研究结果显示，这两种细胞都能产生软骨蛋白聚糖和细胞外基质蛋白，软骨相关基因表达上调。特别值得注意的是，iNCC-MSC来源的软骨形成pellets在尺寸上明显更大，且具有较高的GAG/DNA比值(38.99 +/- 3.14 μg GAG/μg DNA)。然而，两种细胞类型都观察到COL X蛋白表达，iNCC-MSC来源的软骨形成pellets中COL10A1基因表达显著上调，表明软骨细胞存在肥大化倾向。而iCP来源的软骨形成pellets高表达COL I，这是纤维软骨的标志物。

筛选平台的效率

通过预筛选实验，研究团队确认了检测平台的运行效率。他们计算了Z′因子作为检测质量的衡量指标，结果显示开发的检测平台能够识别在BM-MSCs和iCPs中增强GAG合成的分子。然而，iNCC-MSCs的培养条件需要进一步优化，因为无法获得可接受的Z′值。在0.5×10⁵个细胞/孔或1×10⁵个细胞/孔的接种密度下，在PDGF BB、TGFβ3和BMP4存在下培养14天后，无法检测到iNCC-MSCs中的GAG合成。

软骨形成14天后命中化合物的识别

经过14天的小分子筛选平台检测，研究发现没有小分子能够比基线对照组进一步增强BM-MSCs的GAG合成。相反，一些分子特别是在较高浓度下，表现出抑制或降低GAG合成的负面效应。然而，在iCPs中，所有三种浓度的毛喉素(50μM、25μM和10μM)都能显著增强GAG合成。与基线对照组相比，培养在10μM芝麻素、25μM和10μM黄芩苷中的GAG量增加了一倍以上。从这一分析中，毛喉素、芝麻素和黄芩苷被视为命中化合物。与BM-MSCs类似，一些小分子在iCPs中抑制或减少了GAG产生。在iNCC-MSCs中，毛喉素促进了GAG合成，其中50μM毛喉素产生的GAG量最高。

研究团队开发的小分子筛选平台成功在iPSC来源细胞中识别出了命中化合物。毛喉素、芝麻素和黄芩苷增强了iCPs中的GAG合成。在软骨形成生长因子存在的情况下，毛喉素促进了iNCC-MSCs中的GAG合成。然而，iNCC-MSC筛选平台被证明不是最理想的，因为在单独使用生长因子14天后无法检测到GAG合成。因此，使用iNCC-MSCs无法可靠地识别命中化合物，也无法得出关于潜在命中化合物的结论。该检测未在BM-MSCs中识别出命中化合物，对于这种细胞类型，没有小分子能比单独使用TGFβ3进一步增强GAG合成。

这项研究的重要意义在于它展示了一种新的药物筛选策略，利用iPSC技术来发现潜在的OA治疗药物。三种被识别的天然化合物——毛喉素、芝麻素和黄芩苷，都来自药用植物，这为开发天然来源的OA治疗药物提供了新的方向。这些化合物可能通过不同的机制增强软骨形成，如毛喉素作为腺苷酸环化酶激活剂，芝麻素可能通过激活BMP2和雌激素受体α(ERα)信号传导，而黄芩苷则通过激活HIF-1α和TGFβ/Smad信号通路发挥作用。

该研究的另一个重要贡献是强调了小分子活性和其效果对培养条件的依赖性，包括细胞类型、分子浓度和处理时间等因素。这一发现提醒研究人员在开发基于iPSC的筛选平台时需要仔细优化实验条件，以确保检测结果的可靠性和可重复性。

未来研究方向包括在更多细胞系中验证毛喉素、芝麻素和黄芩苷的促软骨形成作用，在更长的培养时间内进行评估，并通过qPCR和免疫荧光染色评估软骨ECM成分的表达。研究这些小分子化合物的组合是否能在没有生长因子的情况下诱导或挽救软骨形成，并增强透明样关节软骨的产生而无需肥大分化，也将是重要的研究课题。促进软骨形成使用小分子化合物而非生长因子可以降低运行分化实验的总成本，因为购买生长因子的成本相当高。需要进行体内研究来评估毛喉素、芝麻素和黄芩苷用于软骨修复的药物应用，并评估其毒性效应。应该比较全身给药、直接递送到关节以及用这些化合物预处理细胞基植入物以增强ECM质量等方法。

总之，这项研究证明了基于iPSC的小分子筛选平台可以成功识别潜在的DMOADs，并且本研究中识别的小分子化合物可能有助于从iPSCs增强推导出关节软骨。这项工作为开发新的OA治疗方法提供了重要的平台技术和候选化合物，为解决这一全球性健康问题贡献了有价值的科学资源。