基于结构药物设计发现新型多环支架高效抑制人源P2X7受体及其机制研究

　　本刊推荐：P2X7受体(P2X7R)是炎症疾病的重要靶点，但物种间药理差异阻碍了其拮抗剂的临床转化。为解决该问题，研究人员通过结构生物学与计算模拟相结合的手段，解析了人源P2X7R的全长结构，并基于此设计了新型多环支架拮抗剂UB-MBX-46。该化合物对人源P2X7R具有亚纳摩尔级抑制活性(IC50=0.514nM)和高选择性，展现了显著的 therapeutic potential。

　　

在炎症、癌症和神经退行性疾病等多种病理过程中，细胞外ATP(adenosine triphosphate)浓度异常升高，会激活一种名为P2X7受体(P2X7 receptor, P2X7R)的离子通道，进而触发NLRP3炎症小体组装和细胞因子释放等免疫反应。尽管阻断过度活跃的P2X7R信号传导具有治疗潜力，但尚无P2X7R拮抗剂成功上市。这主要是由于不同物种（人、大鼠、小鼠）的P2X7R存在显著药理差异，且缺乏人源受体的精细结构信息，导致临床前研究数据难以预测人体疗效。例如，曾进入II期临床试验的AZD9056对类风湿关节炎疗效有限，而JNJ7965567和AZ11645373等化合物也表现出显著的物种特异性效应。因此，开发一种能特异性高效抑制人源P2X7R(hP2X7R)且在小鼠等模式生物中保持足够活性的拮抗剂，成为该领域亟待突破的关键问题。

为破解这一难题，由Steven E. Mansoor和Santiago Vázquez等领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新成果。他们综合运用单颗粒冷冻电镜(cryo-electron microscopy, cryo-EM)、分子动力学模拟(molecular dynamics simulations, MD)、电生理功能验证和药物化学设计等多种技术手段，首次解析了全长野生型人源P2X7R在apo关闭状态、ATP结合开放状态以及与金刚烷基抑制剂UB-ALT-P30复合状态的高分辨率结构，并通过结构比对揭示了物种间药理差异的分子基础。在此基础上，他们设计并合成了一种具有全新多环支架的高效拮抗剂UB-MBX-46，其抑制活性达到亚纳摩尔级别，并表现出优异的选择性。

研究的关键技术方法主要包括：利用冷冻电镜解析了人源、小鼠和大鼠P2X7R的apo关闭状态结构（分辨率达2.5?）以及人源受体与ATP（3.0?）和拮抗剂（2.8?）的复合物结构；采用分子动力学模拟分析配体-受体相互作用和相对结合自由能；通过双电极电压钳(two-electrode voltage clamp, TEVC)技术测定ATP的EC₅₀值和拮抗剂动力学参数；利用生物层干涉技术(biolayer interferometry, BLI)直接测量ATP与受体的结合亲和力；通过钙内流实验(calcium influx assays)和溴化乙锭积累实验(ethidium bromide accumulation assays)全面评估化合物的抑制活性和亚型选择性。

P2X7R orthologs have distinct allosteric binding sites

通过比较人、鼠、大鼠P2X7R的apo状态结构，研究发现人源受体胞外域存在两个独特的胆固醇半琥珀酸酯(cholesterol hemisuccinate, CHS)结合位点，可能与受体稳定性相关。更重要的是，人源受体的经典变构口袋中存在三个关键氨基酸差异：F95（大鼠为L95）、F108（大鼠为Y108）和V312（大鼠为A312）。其中V312的较大侧链迫使相邻保守残基Y295采取独特的旋转构象，导致人源受体的变构口袋比鼠源更紧缩，这种空间形状的差异直接影响了变构拮抗剂的结合模式。

P2X7R orthologs have distinct orthosteric ATP-binding sites

人源P2X7R的ATP结合开放状态结构显示，其整体架构与大鼠受体相似，但跨膜区和胞质域存在明显旋转，导致整体高度降低约4?。ATP结合口袋中七个关键残基（K64、K66、T189、K193、N292、R94、K311）在所有P2XR亚型中保守，但人源特有的I214、Y288等残基可能通过疏水相互作用调节ATP结合药理特性。功能实验测得ATP对人、小鼠、大鼠受体的EC₅₀值分别为89μM、70μM和34μM，BLI实验直接测得ATP与人源受体的解离常数K_D=650nM，较大鼠受体（K_D=540nM）略高。

The classical allosteric pocket of the hP2X7R can fit larger cage alkyls

金刚烷基化合物UB-ALT-P30对人源P2X7R表现出纳摩尔级抑制活性（IC₅₀=17.8nM），且对大鼠和小鼠受体的活性分别降低6.5倍和8.3倍，具备一定物种选择性。其冷冻电镜结构显示该化合物以“浅结合”模式结合于经典变构口袋，金刚烷基主要与F95、F103、M105、F293、Y295和V312形成疏水相互作用。值得注意的是，人源特有的F95侧链指向远离配体的方向，导致金刚烷基周围产生约58?³的空腔，这为后续优化提供了结构基础。

UB-MBX-46 is a P2X7R antagonist with an improved scaffold

研究团队通过结构引导的药物设计，合成了六种不同多环核心的化合物。利用热力学积分结合分子动力学模拟(thermodynamic integration coupled with MD simulations, TI/MD)计算相对结合自由能(relative binding free energies, RBFEs)，预测UB-MBX-46（ΔΔG_B,TI/MD=-2.77kcal/mol）和UB-MBX-P2具有最佳结合能力。功能实验证实UB-MBX-46的抑制活性（IC₅₀=0.514nM）比先导化合物UB-ALT-P30提高35倍，且对人源受体的选择性显著高于大鼠（80倍）和小鼠（9倍）受体。该化合物对其他P2XR亚型（P2X1、P2X2、P2X3、P2X4）几乎无抑制活性，展现出优异的亚型选择性。

UB-MBX-46 is a potent and selective antagonist for the hP2X7R

UB-MBX-46与人源P2X7R的复合物结构（2.5?）揭示了其高效结合的分子机制：其四环[4.4.0.0^3,9.0^4,8]癸烷支架完美契合人源受体变构口袋的几何形状，与V312、F95等残基形成密集的疏水相互作用；腙连接链与D92的羰基氧和Y298的侧链羟基形成双氢键，比UB-ALT-P30多一个氢键相互作用；氯苯基部分与F88、M105、F108、W167和I310形成疏水作用，并与K297产生阳离子-π相互作用。分子动力学模拟进一步表明，UB-MBX-46具有更低的去溶剂化惩罚，更有利于从水相转移到受体的疏水口袋中。

该研究不仅提供了首个全长野生型人源P2X7R的高分辨率结构信息，揭示了物种间药理差异的结构基础，还通过合理的结构引导药物设计成功开发出具有亚纳摩尔级活性和高选择性的新型拮抗剂UB-MBX-46。这一突破性进展为开发治疗炎症性疾病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病和某些癌症的P2X7R靶向药物奠定了坚实的理论基础，提供了具有显著治疗潜力的先导化合物。研究中所采用的综合结构生物学、计算模拟和功能验证的策略，也为针对其他具有物种特异性挑战的药物靶点开发提供了可借鉴的研究范式。