基于网络药理学与实验验证揭示淫羊藿苷调控ESR1/AKT通路延缓睾丸衰老的作用与机制

　　本研究针对男性生殖衰老过程中睾丸活性氧(ROS)积累导致睾酮合成减少和精子发生受损的关键问题，通过整合网络药理学、分子对接和体内实验验证，首次系统揭示了传统中药活性成分淫羊藿苷(ICA)通过激活ESR1/AKT信号通路，显著降低衰老睾丸中ROS、MDA和Fe2+水平，恢复睾酮合成并减轻细胞衰老的多靶点保护机制，为开发抗睾丸衰老的干预策略提供了重要理论依据。

　　

随着全球老龄化进程加速，男性生殖健康问题日益凸显。睾丸作为男性重要的生殖器官，在衰老过程中会出现进行性功能衰退，表现为精子质量下降、睾酮水平降低和生育能力减退。研究表明，50岁以上男性精子产量减少超过30%，精子活力每5年下降1.2%，60岁以上男性中20%-50%存在血清睾酮水平降低。这些变化与活性氧(ROS)在睾丸中的逐渐积累密切相关，过量的ROS会直接减少睾酮合成并损害精子发生，诱导男性生殖衰老。环境毒物如邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)的暴露进一步加剧了这些年龄相关病理变化。然而，安全有效的干预措施仍然有限。

淫羊藿苷(Icariin, ICA)是从传统中药淫羊藿中提取的黄酮类化合物，具有多种生物活性，包括减轻氧化应激、抗肿瘤作用和调节炎症等。先前研究表明，ICA能够减轻DEHP诱导的小鼠 Leydig细胞氧化应激损伤和睾酮合成障碍，但其对男性生殖衰老的治疗作用和机制尚不清楚。

为了深入探究ICA对睾丸衰老的保护作用及机制，研究人员在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上发表了一项整合网络药理学和实验验证的研究。研究采用网络药理学方法系统预测ICA作用于睾丸衰老的靶点和通路，通过分子对接和分子动力学模拟验证关键靶点结合能力，并使用12月龄ICR雄性小鼠模型，通过口服灌胃给予100 mg/kg ICA持续4周，评估其对睾丸衰老的保护效果。主要技术方法包括：通过网络药理学数据库( SwissTargetPrediction、PharmMapper、SuperPred)筛选潜在靶点；使用STRING数据库和Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络；采用Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)进行功能富集分析；运用分子对接和分子动力学模拟验证结合能力；通过Western blotting、ELISA、MDA检测、Oil Red O染色、β-半乳糖苷酶染色、ROS测定和细胞内铁离子成像等技术进行实验验证。

3.1. 淫羊藿苷抗睾丸衰老的潜在靶点

通过整合分析，研究人员从 SwissTargetPrediction、PharmMapper和SuperPred数据库中确定了447个ICA的潜在分子靶点，从GeneCards和OMIM数据库中获得了1255个睾丸衰老相关靶点。交集分析发现了125个重叠基因，这些基因代表了ICA预防睾丸衰老的有希望的治疗靶点。

3.2. 潜在靶点的富集分析

GO富集分析显示，靶点基因富集于"Leydig细胞分化"、"细胞对活性氧的反应"、"脂质储存的负调控"、"雄激素代谢过程"和"铁死亡的负调控"等术语。KEGG富集分析表明，靶点基因涉及细胞衰老、紧密连接和PI3K-AKT信号通路。通过PPI网络拓扑分析，研究人员进一步确定了27个核心靶点，并使用CytoHubba插件基于Maximal Clique Centrality(MCC)评分筛选出前五个枢纽基因：ESR1、TP53、BCL2、HIF1A和TNF。

3.3. 前五个枢纽基因的功能关联网络分析

GeneMANIA功能分析显示，HIF1A在细胞对缺氧反应和激素生物合成过程调节中起核心作用；TNF是脂质生物合成过程和细胞对氧化应激反应的关键调节因子；ESR1与核激素受体结合和类固醇激素介导的信号通路显著相关；TP53和BCL2在凋亡信号通路正调控中发挥核心作用。

3.4. 淫羊藿苷与核心靶蛋白的分子对接验证

分子对接分析显示，ICA与所选靶标的亲和力均低于-6.0 kcal/mol，证实了强大的结合相互作用，支持了网络药理学预测的可靠性。三维结合构象可视化揭示了参与常规氢键和范德华相互作用的关键残基。

3.5. 分子动力学模拟研究

分子动力学模拟结果表明，ICA-蛋白质复合物构象在模拟过程中逐渐稳定，RMSD和Rg值逐渐稳定。氢键分析显示ICA表现出可变的氢键模式，与ESR1形成2-3个键，与BCL2形成0-1个键，与HIF1A形成1-5个键，与TP53形成0-7个键，与TNF形成3-8个键。结合自由能计算显示，ICA与各靶蛋白均具有较强的结合能力。

3.6. 淫羊藿苷保护后睾酮水平的变化

体内实验表明，ICA治疗组的小鼠精子数量和睾酮水平显著高于对照组。Western blot分析进一步表明，ICA治疗组中类固醇生成酶(STAR、CYP11A1、HSD3B1和HSD17B3)的表达水平高于对照组。

3.7. 淫羊藿苷显著抑制衰老睾丸中的铁死亡

DHE荧光染色表明，ICA能够显著抑制衰老睾丸中的ROS积累。RhoNox-1荧光分析显示，ICA治疗组的Fe²⁺水平低于载体对照组。MDA检测证实脂质过氧化减轻。Western blot结果表明，ICA治疗组中CATALASE和NRF2表达上调，cleaved-CASP3表达下调。Oil Red O染色显示，ICA能够消除衰老睾丸中的脂质积累，特别是在Leydig细胞中。

3.8. 淫羊藿苷治疗消除了衰老睾丸中的细胞衰老

SA-β-gal染色显示，ICA治疗组中SA-β-gal阳性细胞数量显著低于载体对照组。此外，研究人员检测了细胞衰老中的关键信号分子，包括SRC、AKT和p21。Western blot分析表明，ICA处理增加了SRC、AKT和p21的磷酸化，同时降低了p21的总蛋白表达。

研究结论表明，ICA可能通过减轻氧化损伤和细胞衰老，并促进睾酮合成，对睾丸衰老发挥保护作用，其中ESR1作为关键介质。这些发现确立了ICA作为年龄相关性睾丸功能障碍的有效改善剂。

讨论部分强调，睾丸衰老的特征是关键信号通路的进行性失调以及ROS积累。ICA治疗通过降低ROS积累、脂质过氧化和Fe²⁺水平，同时上调衰老睾丸中的NRF2，显著减轻了氧化应激。有证据表明，ICA可以靶向ESR1来增强TM4小鼠Sertoli细胞系中的NRF2信号通路。这些结果表明，ICA通过激活NRF2介导的抗氧化通路抑制铁死亡，从而减轻睾丸衰老。

该研究的重要意义在于首次系统阐明了ICA通过多靶点、多通路方式对抗睾丸衰老的机制，为开发针对男性生殖衰老的干预策略提供了重要的理论基础和实验依据。特别是发现ESR1作为ICA的关键作用靶点，调控AKT信号通路活化，进而影响睾酮合成、氧化应激和细胞衰老等多个生物学过程，这为理解中药活性成分的作用机制提供了新的视角。研究结果不仅对延缓男性生殖衰老具有重要的临床意义，也为传统中药的现代化研究提供了范例。