生物素偶联药物递送：SMVT转运机制质疑与替代途径探索

　　本综述通过实验验证提出颠覆性观点：钠依赖性多维生素转运体(SMVT)并非生物素偶联物的主要转运载体。研究采用生物素化一氧化碳(CO)前药对(BCO-101a/b)，通过富集触发释放(ETR)策略和流式细胞术分析，发现过量生物素竞争实验未抑制癌细胞摄取，而羧基缺失的生物素类似物(Bio-1/Bio-2)呈现增强/抑制双重效应，表明存在未知转运机制，对靶向药物开发具有重要指导意义。

　　

摘要

钠依赖性多维生素转运体(SMVT)作为生物素转运蛋白在多种癌细胞中过度表达，常被用于生物素偶联物的靶向药物递送研究。然而这类偶联物缺乏SMVT识别所需的羧基。本研究通过细胞实验评估生物素偶联CO前药对的细胞内富集和活化过程，发现虽然SMVT过表达细胞中存在前药富集，但过量生物素并未影响该富集过程。两种缺乏羧基的生物素类似物根据特定结构特征分别呈现增强或抑制效应，这些发现支持SMVT并非生物素偶联物转运载体的观点，强调需要进一步研究生物素偶联物的转运机制。

引言

开发副作用最小化的新型有效抗癌药物是药物发现领域的重大挑战。靶向治疗策略包括抗体偶联药物(ADCs)、免疫治疗、光动力治疗、纳米载体治疗、适体介导和微量营养素介导的药物递送。与本研究特别相关的是广泛报道的生物素与已知药物的偶联物用于靶向递送。生物素作为微量营养素在氨基酸、脂肪酸和碳水化合物代谢中起重要作用。白血病、卵巢癌、肺癌、宫颈癌和乳腺癌等癌细胞显示出对生物素的高需求。SMVT被认定为生物素转运蛋白，在癌细胞中常过度表达。因此生物素修饰的树状聚合物、脂质体、小有机分子和纳米颗粒已被研究用于癌症靶向治疗。

通常生物素通过其羧酸基团与载荷形成酰胺或酯键进行偶联。然而游离羧酸对SMVT识别生物素分子的关键作用已在肠细胞、结肠细胞、肝细胞和肾细胞等多种细胞系中得到证实。这引发重要问题：缺乏游离羧酸盐基团的生物素偶联物如何被细胞摄取？2023年我们提出疑问：生物素偶联物的转运是通过SMVT还是其他未知途径？当代意义在于解决现有信息的孤立性——SMVT转运的结构活性关系(SAR)研究明确显示需要羧基，但使用生物素偶联物进行SMVT介导药物递送的研究仍在持续。

我们选择CO作为载荷，因已开发可适应本研究的双分子CO前药对。富集触发前药活化概念基于双分子反应浓度依赖性的反应速率。富集前药和触发分子可加速前药活化，实现选择性和可控递送。CO作为内源性分子具有抗炎、抗癌和器官保护作用，只有在高浓度时才具有毒性，具有足够的治疗安全边际。

结果与讨论

基于富集触发释放(ETR)策略，我们设计了生物素偶联CO前药对，利用逆电子需求狄尔斯-阿尔德(IEDDA)反应形成降冰片二烯-7-酮中间体，自发通过螯裂反应释放CO。本研究将相同概念应用于生物素介导的癌细胞细胞内富集和触发释放。

通过已发表的合成程序，生物素偶联CO前药对顺利合成。BCO-101a/b通过酰胺化偶联合成，CO释放产物BCP-101通过IEDDA反应合成。还合成了Bio-1和Bio-2用于体外竞争实验。

根据既定程序，我们使用荧光分光光度法测定了BCO-101a和BCO-101b之间的反应速率常数(k₂)，确定为2.31±0.42 M^?1 s^?1。根据文献报道，生物素与载荷偶联通常导致癌细胞摄取增强2-5倍。基于获得的k₂值，生物素偶联CO前药对在10μM浓度下的第一个半衰期估计为12.02小时。假设基于文献报告约5倍富集，估计第一个半衰期缩短至2.4小时。这样的速率常数适合我们的实验目的。

大多数报道研究使用过量游离生物素进行竞争试验，证明缺乏游离羧酸的生物素偶联物通过SMVT介导的摄取。然而SMVT需要生物素结构的游离羧酸进行识别，这已在肝细胞、肠细胞、上皮细胞和肾细胞等多种细胞系中得到证实。因此我们感兴趣的是使用生物素及其缺乏游离羧酸的类似物进行竞争实验。我们采用Bio-1作为生物素的结构类似物，其中哌啶通过酰胺键与生物素偶联。由于生物素和Bio-1相对于BCO-101a和BCO-101b是相对较小的分子，我们将另一种底物Bio-2纳入竞争试验，以检验分子大小在体外竞争实验中是否产生显著差异。

已知HeLa(人宫颈癌)和MCF-7(人乳腺癌)等癌细胞比健康细胞如HEK-293(人胚胎肾)细胞表达更高水平的生物素转运蛋白。因此选择这些细胞系进行细胞培养试验。

首先我们测试了BCO-101a、BCO-101b和BCP-101在HeLa细胞中的细胞毒性，发现在高达100μM浓度下无毒性。用生物素偶联CO前药对BCO-101a和BCO-101b处理HeLa、MCF-7和HEK-293细胞。通过流式细胞术监测荧光环化产物BCP-101的形成来确定富集触发CO释放。发现HeLa细胞中荧光细胞百分比比HEK-293细胞高约9倍，MCF-7细胞中比HEK-293细胞高约6倍。这些实验证明HeLa和MCF-7细胞比HEK-293细胞具有增强的生物素偶联物富集能力。

为探究生物素介导的富集过程是否是SMVT介导的事件，我们使用过量(200和500μM)生物素进行体外竞争实验。HeLa细胞先用生物素处理1小时，然后刷新含有生物素和10μM BCO-101a/b的培养液，再培养4小时后进行流式细胞术分析。与SMVT需要游离羧基进行识别的观点一致，20倍和50倍过量的生物素竞争并未降低HeLa细胞对生物素偶联CO前药对的摄取。

我们还检查了较低浓度CO前药对的浓度效应。用50或100μM生物素预处理HeLa细胞1小时，然后在50或100μM生物素存在下培养0.5μM BCO-101a/b。荧光阳性细胞数量似乎有边际减少，这与生物素偶联物与天然底物(生物素)竞争的情况不成比例。为进一步探究这个问题，我们使用更高浓度的生物素(2mM)和Bio-1(2mM)作为竞争试验的底物。有趣的是，2mM生物素处理导致生物素偶联CO前药对摄取边际增加。

此时需要审视关键问题：生物素偶联物的细胞转运是否由生物素转运蛋白SMVT介导？我们先前发表的论文证明SMVT需要游离羧基来识别生物素进行细胞内转运。使用该羧基进行偶联当然消除了这一关键结构特征。上述体外竞争实验表明CO前药对的转运独立于SMVT。这引发问题：生物素偶联物的转运是否由另一种不依赖结构中游离羧基存在的未知机制介导？

因此我们用缺乏游离羧基的生物素类似物Bio-1和Bio-2进行竞争实验。有趣的是，用2mM Bio-1处理，BCO-101a和BCO-101b的摄取增强了近2倍。这种生物素偶联CO前药对摄取的增强在较低浓度(50μM和100μM)的Bio-1中也明显。由于结果的意外性，我们研究了另一种生物素类似物Bio-2在竞争试验中的作用。有趣的是，使用Bio-2的竞争实验导致HeLa和MCF-7细胞中对生物素偶联CO前药对摄取的显著抑制，且呈剂量依赖性。

无论最终发现如何，很明显不能假设通过羧基衍生物进行生物素偶联会产生能够被SMVT转运的偶联物。早期许多文献报告支持相同的论点。过去药物化学家大多使用游离生物素与生物素偶联物进行体外竞争实验，以确定生物素化分子在癌细胞中的摄取机制。然而如先前所述，生物素可能不会在此类试验中作为竞争性底物，因为此类生物素偶联物缺乏SMVT介导细胞内转运所需的羧酸基团。泛酸(另一种SMVT配体)的结构活性关系(SAR)研究清楚强调了泛酸游离羧酸对其通过SMVT跨膜转运的关键性质。

结论

应用ETR策略，我们开发了生物素偶联CO前药对BCO-101a和BCO-101b，显示HeLa和MCF-7癌细胞中生物素偶联CO前药对摄取分别比非癌HEK-293细胞增强约9倍和6倍。有趣的是，在使用流式细胞术的竞争试验中，过量生物素并未降低HeLa和MCF-7细胞对BCO-101a和BCO-101b的摄取。相反，缺乏游离羧酸的生物素结构类似物Bio-1和Bio-2在HeLa细胞中分别诱导BCO-101a和BCO-101b摄取的增强和抑制，且呈剂量依赖性。与HeLa细胞类似，Bio-2在MCF-7细胞中也显示剂量依赖性竞争抑制生物素偶联CO前药对的摄取。这些结果表明SMVT不是负责促进缺乏游离羧酸的生物素偶联物摄取的载体。最有可能的是，一个未知的机制负责。此外HeLa细胞对Bio-1和Bio-2的对比反应表明参与BCO-101a和BCO-101b转运的转运蛋白/受体蛋白具有特定的结构要求。这项工作强调了在竞争试验中使用适当设计的具有修饰羧酸和不同结构特征的生物素类似物作为底物的必要性，以准确理解生物素偶联物的摄取机制。

材料与方法

所有溶剂和试剂从商业供应商购买并按标准程序纯化。所有反应通过薄层色谱(TLC)监测。高分辨率质谱(HRMS)分析使用ABI API 3200仪器进行。核磁共振(NMR)谱在Bruker Advance AC 400MHz谱仪上记录。

细胞培养和细胞毒性测试使用HeLa、MCF-7和HEK-293细胞。细胞培养物根据制造商推荐方案传代。使用CCK-8试剂盒评估细胞活力。所有测试进行三次重复，IC₅₀值通过非线性回归确定。

流式细胞术实验中，测试化合物在DMSO中制备10mM储备溶液。对于竞争试验，细胞用底物处理1小时，然后刷新含有底物和生物素偶联CO前药对的培养液。在37°C培养4小时后，通过流式细胞仪分析细胞。

反应动力学研究通过荧光分光光度法进行，通过监测CO前药对BCO-102a和BCO-102b反应形成的环化产物BCP-101的荧光强度。化合物在PBS:DMSO(3:7)溶液中混合并在37°C培养。使用GraphPad Prism 9.0基于单相关联方程进行非线性回归，计算CO释放半衰期。所有实验进行三次重复。