口服有效4'-氟尿苷前药VV251展现抗SFTSV和LCMV感染的卓越疗效

　　本研究发现口服前药VV251（4'-氟尿苷优化衍生物）在体外和体内实验中均表现出对发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）的强效抑制作用。在细胞模型中，VV251的EC50值达纳摩尔至微摩尔级别；在致死性动物模型中，低剂量口服（SFTSV:10 mg/kg；LCMV:1 mg/kg）即可实现100%存活率，疗效与300 mg/kg T-705相当。药代动力学研究显示其具有良好的吸收和暴露特性，凸显其作为应对布尼亚病毒威胁的新型口服治疗方案的巨大潜力。

　　

引言

布尼亚病毒目（Bunyavirales）病毒是一类分节段的负链RNA病毒，分布广泛。其中多种高致病性成员，如克里米亚-刚果出血热病毒、发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）、汉坦病毒、拉沙病毒（LASV）和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV），可通过节肢动物或啮齿类动物传播给人类，引起白细胞减少、高热和神经系统症状等临床表现，严重威胁人类健康和社会稳定。

发热伴血小板减少综合征（SFTS）是一种由SFTSV感染引起的严重蜱媒人畜共患病，病死率（CFR）可高达30%。目前尚无FDA批准的特效药物或疫苗。瑞德西韦（Ribavirin）和法匹拉韦（T-705, Favipiravir）虽显示出一定的抗病毒活性，但临床效果有限或存在潜在风险（如致畸性）。其他一些钙通道阻滞剂和小分子化合物在体外有效，但缺乏充分的临床验证。

病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）因其在病毒复制中的核心作用和高保守性，是一个极具吸引力的抗病毒靶点。核苷类似物是最大的一类基于小分子的抗病毒药物，通过抑制病毒聚合酶发挥功能。4'-氟尿苷（4′-FlU, EIDD-2794）是一种有前景的尿苷类似物，对多种病毒如呼吸道合胞病毒（RSV）、SARS-CoV-2、禽流感病毒、基孔肯雅病毒、肠道病毒以及SFTSV和LASV、胡宁病毒（JUNV）等均显示出疗效，表明其作为广谱口服抗病毒药物的潜力。然而，4′-FlU在酸性条件下的化学不稳定性限制了其进一步开发。VV251盐酸盐是一种经过结构优化的4′-FlU双重前药，其核糖部分有三个乙酰基修饰，尿嘧啶碱基的N3位有一个烟酰氧甲基，旨在提高口服生物利用度并保持强效抗病毒活性。

结果

体外抗病毒活性

研究首先在不同细胞系中评估了VV251对SFTSV和LCMV的抑制活性，并与母体化合物4′-FlU和阳性对照T-705进行了平行比较。

结果显示，VV251在所有测试的细胞系中对SFTSV和LCMV复制均表现出强效、广谱的抑制作用，其EC₅₀值与4′-FlU非常接近（SFTSV: 0.65–5.16 μM vs 2.03–2.37 μM；LCMV: 0.08–0.16 μM vs 0.04–0.15 μM），这与它们共享相同的活性代谢物4′-氟尿苷三磷酸（4′-FlU-TP）相一致。值得注意的是，与T-705相比，VV251表现出更优的广谱抗病毒活性，在所有测试细胞系中均显示出更低的EC₅₀值。针对SFTSV，VV251的效力分别是T-705的54倍（A549细胞）、4.8倍（Huh-7细胞）和7.0倍（Vero细胞）。针对LCMV，VV251的效力优势更为显著，其EC₅₀值比T-705低849.6倍（A549细胞）和632.9倍（Vero细胞）。

细胞毒性测试显示，VV251、4′-FlU和T-705在不同细胞系上的半数细胞毒性浓度（CC₅₀）值均大于500 μM。基于病毒RNA拷贝数计算的EC₅₀值，这些药物表现出宽泛的选择性指数（SI, CC₅₀/EC₅₀）。对于SFTSV，VV251、4′-FlU和T-705的SI范围分别为96.94–384.25、210.67–245.98和1.79–160.32。对于LCMV，VV251、4′-FlU和T-705的SI范围分别为3177.56–6559.96、3389.68–12697.20和5.64–7.36。这些发现证明了VV251良好的安全性特征。

作用机制研究

为初步探究VV251的作用机制，研究人员进行了核苷竞争实验。结果显示，外源性添加尿苷和胞苷可竞争性逆转VV251对SFTSV和LCMV的抗病毒作用，支持VV251作为嘧啶类似物发挥作用。

通过时间加药实验进一步表征其抗病毒机制。实验设计包括三种处理方式：细胞预处理、感染后处理以及全时段处理。结果表明，与阳性对照T-705（一种公认的靶向复制阶段的病毒RNA聚合酶抑制剂）一致，VV251在感染后处理和全时段处理条件下对SFTSV和LCMV均表现出强效的抗病毒活性。相比之下，预处理VV251显示出极小或无保护作用，表明其作用机制主要是在病毒活跃复制期间有效，而非通过预先阻断病毒进入。

药代动力学分析

作为一种酯类前药，VV251在肠道和肝脏中被各种酯酶迅速转化为其母体核苷4′-FlU，后者随后分布到血液和细胞中，并最终在一系列激酶的催化下代谢为活性形式4′-FlU-TP。

在斯普拉格-道利（SD）大鼠和食蟹猴中进行的药代动力学（PK）研究比较了口服给药后VV251与等摩尔4′-FlU的系统暴露量。PK分析显示，口服VV251（21 mg/kg）达到了与等摩尔4′-FlU相当的系统暴露量，平均血浆最大浓度（C_max）为1598 ng/mL，血浆暴露量（药时曲线下面积[AUC_0–t]）为9714 ng·h/mL。这些参数与4′-FlU本身观察到的参数非常接近（C_max: 1369 ng/mL; AUC_0–t: 7277 ng·h/mL）。在食蟹猴模型中，VV251（10.7 mg/kg）也保持了与4′-FlU相似的PK特性（C_max: 2358 vs 1505 ng/mL; AUC_0–t: 14922 vs 10687 ng·h/mL），证实了其良好的吸收和暴露特性。

VV251相较于4′-FlU改善的吸收归因于其优化的分子结构。其盐酸盐形式具有良好的水溶性，可能增强口服生物利用度。

体内抗SFTSV功效

在IFNAR1敲除小鼠（A129）模型中评估了VV251的抗SFTSV感染潜力，该模型对SFTSV感染高度敏感。T-705被选为阳性对照。

小鼠腹腔感染1 × 10³ PFU的SFTSV后，从感染后1小时开始，连续7天每天一次口服给予 vehicle、T-705（300 mg/kg）或VV251（1、5、10 mg/kg）。感染后2天采集器官和血液样本，另一组小鼠监测体重变化和存活率。

所有接受VV251 10 mg/kg剂量和T-705 300 mg/kg剂量治疗的动物均存活。VV251（10 mg/kg）组小鼠体重保持稳定，而T-705组小鼠在感染初期出现轻微体重下降，后在感染后5天体重恢复。Vehicle组所有小鼠和接受VV251 5 mg/kg剂量的一只小鼠在感染后3天死亡，vehicle组剩余小鼠在感染后4天死亡。接受最低剂量VV251（1 mg/kg）的小鼠比vehicle组存活时间延长，但其中五只于第5天死亡，并观察到显著的体重减轻，仅一只小鼠存活至研究结束。总体而言，与T-705相比，每天一次10 mg/kg的VV251治疗能高效保护小鼠免受SFTSV感染，并保持相对稳定的体重。

与Vehicle治疗相比，所有剂量的VV251和T-705均导致肝脏、脾脏、肺和肾脏中的病毒载量显著降低（通过qRT-PCR和免疫空斑试验评估）。组织病理学分析显示，Vehicle组出现明显的脾肿大，而所有测试剂量的VV251和T-705均能显著改善此现象，病理学评分显著降低，脾脏中SFTSV抗原分布呈剂量依赖性减少。H&E染色进一步证明，VV251和T-705治疗有效减轻了SFTSV诱导的脾损伤（如白髓红髓分界消失、血管周围白细胞浸润和肺泡间隔增厚）。这种保护作用延伸至肺组织，VV251和T-705治疗显示出改善的组织结构和显著降低的病理学评分。

此外，对EDTA抗凝全血的分析表明，感染引起的病毒血症导致严重的白细胞减少、淋巴细胞减少和血小板计数下降，T-705和VV251治疗均能缓解这些症状。感染后，Vehicle组血浆中干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）浓度迅速升高，而所有剂量的VV251和T-705治疗均显著降低了这些细胞因子的水平，可能有效防止了细胞因子风暴的形成。

结果验证了VV251抗SFTSV的有效性，表现为病毒载量降低、组织病理学改善、病毒血症减轻和促炎反应减弱。每天一次口服10 mg/kg VV251在小鼠中显示出与300 mg/kg T-705相当的功效和安全性。

体内抗LCMV功效

在C57BL/6-Prf1^tm1Sdz/J小鼠模型中评估了VV251的抗LCMV功效，以确立其广谱抗病毒效力。

小鼠腹腔感染2 × 10⁵ PFU LCMV后，从感染后1小时开始，连续7天每天一次口服给予 vehicle、T-705（300 mg/kg）或VV251（1、5、10 mg/kg）。感染后5天采集器官和血液样本用于检测，另一组小鼠监测体重变化和存活率。

与Mock组相比，所有剂量VV251治疗组小鼠体重保持稳定。值得注意的是，即使最低剂量的VV251（1 mg/kg）也能确保小鼠存活。相反，Vehicle组所有小鼠在感染后9天内死亡。与VV251相比，300 mg/kg的T-705对LCMV感染的保护作用较差，表现为体重变化与Vehicle组平行，死亡从感染后7天开始，研究结束时无存活者。

感染后第5天，通过qRT-PCR和免疫空斑试验分别评估肝脏、脾脏、肺和肾脏中的病毒RNA拷贝数和滴度。结果显示，VV251治疗显著降低了器官中的病毒RNA拷贝数和滴度，病毒RNA拷贝数比Vehicle组低一个数量级以上。相比之下，T-705给药降低了组织中的病毒滴度，但除肺部外，未观察到病毒RNA拷贝数的减少，这可能与T-705独特的作用机制有关。

此外，VV251治疗有效改善了脾脏损伤，表现为脾脏大小正常和病理学评分降低。H&E染色显示，VV251治疗组脾脏白髓和红髓分界清晰，边缘区保存完好，而Vehicle组和T-705治疗组则呈现明显的病理损伤。

对EDTA抗凝全血的血液学参数分析表明，口服VV251改善了LCMV感染引起的病毒血症。相反，T-705治疗组的白细胞、血小板和淋巴细胞计数与Vehicle组相似。对血浆细胞因子水平的分析显示，与Vehicle治疗相比，所有剂量的VV251治疗均导致IFN-γ和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）的表达显著降低，而300 mg/kg的T-705治疗则无显著影响。因此，细胞因子反应的降低可能是VV251治疗对抗致死性LCMV感染保护作用的关键因素。

基于上述结果，最低剂量1 mg/kg的VV251比300 mg/kg的T-705具有更强的抗LCMV效果，它能保护C57BL/6-Prf1^tm1Sdz/J模型小鼠免受致死性LCMV感染，同时维持其体重和存活率。VV251治疗不仅降低了感染后的病毒载量，还诱导了多器官组织病理学改变的改善。

讨论

由于缺乏FDA批准的疫苗或特效药物，布尼亚病毒感染的临床治疗手段有限，威胁社会经济稳定和人类健康。需要有效的口服抗病毒药物来治疗有发展为严重症状风险的门诊患者。近期报道的尿嘧啶类似物4′-FlU可有效抑制Heartland病毒、SFTSV、LASV和JUNV（均属布尼亚病毒目）。然而，4′-FlU在水溶液中，尤其是在酸性条件下（pH <4）化学稳定性差，可能由于糖苷键在此类酸性环境中更易断裂，阻碍了其作为候选药物的进一步发展。

为解决这些局限性，研究人员开发了VV251，一种口服生物可利用的前药，是4′-FlU的结构优化嘧啶核苷类似物，旨在增强口服给药后母体核苷的系统递送。初步研究表明，VV251的游离碱形式比4′-FlU具有更好的稳定性和药代动力学特征，但结晶困难和制剂稳定性问题阻碍了其作为先导候选物的推进。借鉴VV116开发中成功的结构优化方法，研究人员随后制备了VV251盐酸盐，其表现出改善的固态特性和水溶性。这些有利的理化性质使其成为替代的开发候选物，并推动了对其药效学特性的进一步评估。

本研究使用VV251盐酸盐全面评估了其抗病毒特性，证明了其在多种细胞培养系统中对SFTSV和LCMV的广谱活性。在SD大鼠和食蟹猴中的PK表征揭示了VV251与等摩尔4′-FlU相比良好的吸收特性和系统暴露，为功效研究建立了优化的给药方案。使用T-705作为对两种病毒均具有既定疗效的基准抗病毒剂，研究人员评估了VV251的体内治疗潜力。令人惊讶的是，每天一次口服较低剂量的VV251（SFTSV: 10 mg/kg；LCMV: 1 mg/kg）即可实现完全保护（100%存活），与300 mg/kg T-705的疗效相当。值得注意的是，与T-705相比，VV251治疗在较低剂量下对LCMV感染提供了更好的保护效果，表现为更好地维持体重和减轻组织病理损伤。

为优化大流行防范，针对高度保守的病毒蛋白，尤其是RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）的抗病毒药物具有显著优势，因其对新兴病毒威胁具有潜在效力。使用核苷类似物抑制病毒RdRp的策略已成功应用超过三十年，并具有充分的临床成功记录。研究结果表明，VV251基于其母体化合物4′-FlU已充分证实的抗病毒功效，不仅显示出治疗布尼亚病毒感染的巨大潜力，还可能对其他病毒具有广谱抗病毒活性，尽管在将其应用扩展到布尼亚病毒之外时可能需要剂量优化。

尽管在体外和体内环境中均观察到VV251的功效，但本研究仍存在局限性。一方面，保护作用的广度仅在小鼠中进行了测试，需要额外的动物模型进行整体评估。另一方面，VV251的具体作用机制需要进一步研究，因为核苷类似物可通过三种主要机制靶向病毒RdRp以阻止病毒复制：延迟链终止（如瑞德西韦）、强制链终止（如索磷布韦）和诱变（如莫诺匹拉韦）。先前的研究报道，4′-FlU的磷酸化形式被RSV和SARS-CoV-2的RdRp掺入后会导致序列调节的转录停滞，需要进一步研究以探索VV251抗SFTSV和LCMV的作用机制。此外，为提供VV251分子基础的宝贵见解，需要进一步研究VV251对布尼亚病毒的耐药性特征；然而，在4′-FlU选择压力下传代超过18次后，未观察到JUNV的突破性变异株，这表明VV251可能具有高遗传耐药屏障的潜力，因为它以4′-FlU-TP的形式发挥作用。

有效的口服抗病毒疗法，其靶向保守的病毒蛋白并具有高耐药屏障，对于最大化针对新兴病毒的 therapeutic efficacy 至关重要。研究结果确立了VV251作为一种潜在的口服有效抑制剂，用于治疗SFTSV和LCMV感染，使其成为治疗布尼亚病毒感染的有前途的候选药物。基于4′-FlU对抗多种高致病性病毒的成功，VV251有希望成为一种广谱口服抗病毒药物，用于对抗这些病原体。