人巨细胞病毒末端酶辅助蛋白pUL77与pUL93的功能与结构解析及其在抗病毒治疗中的新靶点意义

　　本文深入探讨了人巨细胞病毒（HCMV）末端酶复合体关键辅助蛋白pUL77和pUL93的多态性、耐药突变及核定位信号（NLS）功能，揭示了它们在病毒复制和包装中的核心作用，为开发新型抗病毒策略（如抑制肽）提供了关键靶点和结构基础。

　　

人类巨细胞病毒（HCMV）是免疫抑制患者和先天性感染患儿发病和死亡的重要原因。现有抗病毒疗法主要靶向病毒DNA聚合酶，但因毒性和耐药性问题应用受限，亟需开发新的治疗策略。letermovir（LTV）通过靶向病毒末端酶复合体（pUL56-pUL89-pUL51）在移植受者预防中显示出良好效果，但耐药突变已然出现。该复合体负责切割病毒基因组并将其包装入新形成的衣壳中，此过程需与多个其他蛋白密切相互作用。本研究聚焦于两个重要的末端酶相关蛋白——pUL77和pUL93，深入探究了它们的天然多态性、LTV预防下出现的突变及其推定的核定位信号（NLS）的功能相关性。

通过对18种疱疹病毒的序列比对，研究揭示了pUL77和pUL93中的保守与可变区域。在LTV治疗患者中出现的新突变并未直接导致耐药，但pUL77 R43C突变与pUL56 C325F共存时，会显著降低仅由C325F引起的LTV耐药水平。此外，在病毒复制背景及质粒转染后的自主细胞生产中评估了核定位 motifs，并鉴定出对病毒复制至关重要的 motifs：pUL77中的₄₃RVRKRYLRQ₅₅和₂₂₅PRWKRV₂₃₁，以及pUL93中的₅₀₅RDRRGRLRR₅₁₃。最后，基于人工智能（AI）的建模为这些 motifs 的功能提供了一些见解，特别是在与其他病毒蛋白相互作用方面。这些数据共同揭示了pUL77和pUL93中潜在的多个功能位点，这些位点可能成为抗HCMV策略（如抑制肽）的新靶点。

保守结构域确定与多态性分析

pUL77和pUL93的同源蛋白序列比对揭示了它们的保守与可变特性。pUL77中存在一个可变区域（VR-I，残基98至181）和五个保守区域（I至V）。一个位于保守区域IV的 motif（₅₂₂DPAVTLSQLFPGLALLAV₅₃₉）在18种疱疹病毒中相对保守，其在HCMV-BAC中的缺失导致重组病毒无法复制。pUL93则显示出更多的可变区域（VR-I、VR-II、VR-III）和七个保守区域。多态性分析表明，pUL77中一个富含突变且包含重复 motif ₁₄₅PSDAVAPSDAVA₁₅₆（在多数参考和临床菌株中缺失）的区域与序列比对中注释的可变区域VR-I一致。pUL93的VR-I、VR-II和VR-III也表现出高度的序列变异性。

在LTV治疗患者中检测到的12株HCMV毒株中，pUL77发现了26个突变，pUL93发现了18个突变。其中，pUL77的两个新突变R43C和A161T，以及pUL93的两个新突变E73G和R206H被特别关注。这些突变常与已知的pUL56耐药突变（如V236M、C325F、C325Y）共存。

新突变的评估

通过将突变引入HCMV-BAC并在MRC-5人胚胎成纤维细胞中进行转染，斑块试验显示，这些单独存在的突变本身并不赋予重组病毒对LTV的抗性。当这些突变与pUL56的耐药突变组合时，除了pUL56 C325F与pUL77 R43C的组合显著降低了耐药水平外，其他组合并未显著改变EC₅₀。细胞生长实验（通过绿色荧光蛋白（GFP）计数评估）表明，这些新突变并未调节病毒的适应度。

推定的核定位信号（NLS）研究

文献中报道的pUL77和pUL93的推定NLS通过突变或缺失在HCMV-BAC GFP中进行研究。研究发现，pUL77 NLS1的单独突变以及pUL77 NLS2中₂₂₅QPRWKRV₂₃₁ motif（NLS2*）的缺失会显著削弱病毒复制。pUL93的ΔNLS1突变在D7时显著降低适应度，而ΔNLS2和ΔNLS1/2突变则没有。通过生物信息学分析，在pUL93的C端区域发现了一个新的推定NLS3（₅₀₅RDRRGRLRR₅₁₃），其缺失完全阻碍了病毒复制。共转染AD169 HCMV-BAC可显著恢复pUL93突变体的核定位能力，表明其他病毒蛋白的参与至关重要。

HEK293T细胞中推定核定位信号的研究

通过构建mCherry融合蛋白并利用共聚焦显微镜观察，评估了野生型和突变型pUL77、pUL93的细胞定位。野生型蛋白均可在细胞核中观察到。pUL77 NLS的单独或组合修饰并未显著影响其进入细胞核。然而，pUL93 NLS1或NLS2的单独缺失以及NLS1/NLS2的组合缺失导致pUL93在细胞核中的信号显著减少。pUL93 NLS3的缺失严重影响其核穿越能力，但AD169的共转染显著恢复了此功能。蛋白质印迹分析证实了mCherry融合克隆的构建，并显示AD169的存在大大增加了所有克隆的产量。

HCMV pUL77和pUL93的结构研究

利用近期解析的HCMV门户顶点冷冻电镜结构（PDB ID: 8TEP），研究在病毒粒子配置1中识别出了pUL77和pUL93的 motifs。pUL77的NLS1位于衣壳结合域（CBD），其富集的阳离子残基（如Arg57和Arg55）与pUL48-u/l的C末端亮氨酸残基的羧酸根形成强静电相互作用，对于维持CBD结构至关重要。pUL77的NLS2和 motif 3位于其“头结构域”表面，未检测到与同一亚基其他衣壳蛋白的相互作用。pUL93的NLS2和NLS3也在解析结构中被识别。NLS3位于pUL77-l N端结构域和主要衣壳蛋白（MCP）之间的界面，其富集的阳离子残基（如Arg507, Arg510, Arg513）与pUL77-l或MCP周围的电负性残基（如Gln476, Gln543, Glu547）发生吸引性静电相互作用。pUL93 NLS1未在实验结构中解析，通过与HSV-1 pUL17（pUL93直系同源物）的结构比对和AlphaFold2预测进行了探索，但该区域在HCMV结构中的缺失表明其可能具有灵活性。

讨论

pUL77和pUL93是HCMV末端酶复合体的重要结构伴侣蛋白。本研究揭示了它们在HCMV参考株和临床分离株中是保守的蛋白，并识别了其可变和保守区域。pUL77中₅₂₂DPAVTLSQLFPGLALLAV₅₃₉ motif的缺失完全阻止了病毒复制，暗示其可能在与pUL48等其他蛋白的相互作用中扮演关键角色。在LTV治疗患者中出现的新突变（pUL77 R43C, A161T；pUL93 E73G, R206H）本身并不引起耐药，但pUL77 R43C与pUL56 C325F的组合意外地减弱了耐药水平，提示pUL77可能与pUL56存在密切相互作用并可调节LTV的作用机制。

对推定NLS的功能研究表明，pUL77的NLS2*（₂₂₅QPRWKRV₂₃₁）和pUL93新发现的NLS3（₅₀₅RDRRGRLRR₅₁₃）对于病毒复制至关重要。这些区域更应被视为重要的功能域而非单纯的核定位信号。结构研究为这些 motifs 在维持蛋白相互作用和复合体稳定性中的作用提供了原子层面的见解。

综上所述，本研究增进了对pUL77和pUL93结构与功能的理解，强调了其三级结构对功能的重要性，并鉴定出新的关键功能 motifs。研究结果表明，这些蛋白，特别是其关键功能域，是开发未来抗HCMV疗法（如靶向性抗病毒药物或抑制肽）的潜在新靶点，为应对抗病毒耐药性这一持续挑战提供了新的思路。