塞内加尔达喀尔大学医院临床碳青霉烯耐药肠杆菌的基因组研究：携带blaNDM-5和blaOXA-48基因的霍氏肠杆菌ST182菌株的传播机制与耐药特征分析

　　本研究深入探讨了塞内加尔达喀尔大学医院临床碳青霉烯耐药肠杆菌（CRE）的流行特征、耐药表型及分子机制，首次通过全基因组测序揭示了霍氏肠杆菌ST182型菌株携带blaOXA-48和blaNDM-5基因的传播动态与多重耐药（MDR/XDR）特性，为西非地区CRE防控提供了关键基因组数据与临床干预策略。

　　

ABSTRACT

塞内加尔面临碳青霉烯耐药肠杆菌（CRE）的涌现与传播，其常导致致命感染。本研究旨在确定达喀尔大学医院临床CRE分离株的抗菌药物敏感性、碳青霉烯酶流行情况，并进行全基因组序列分析。采用MALDI-TOF MS和VITEK2系统进行细菌鉴定与药敏试验，通过终点PCR筛查碳青霉烯酶和头孢菌素酶编码基因，使用Illumina MiSeq平台完成全基因组测序（WGS）。结果显示，CRE分离株对几乎所有测试的34种抗菌药物耐药，但多黏菌素（96%敏感）和阿米卡星（71%敏感）仍保持活性。仅检测到碳青霉烯酶基因bla_OXA-48（53.8%）和bla_NDM（35.7%），以及头孢菌素酶基因bla_CMY-1（25%）。进一步对两株广泛耐药（XDR）霍氏肠杆菌进行WGS分析，鉴定为ST182型，携带多种抗菌耐药（AMR）、金属耐受及毒力相关基因。研究发现一个61,054 bp的IncL/M质粒携带bla_OXA-48，而一个217,745 bp的IncFIB(pECLA)/IncFII(pECLA)/IncX3多复制子质粒携带bla_NDM-5及其他AMR和金属耐受基因。本研究首次揭示了塞内加尔临床CRE的基因组特征，为该国CRE防控提供了关键数据。

INTRODUCTION

碳青霉烯类药物是应对多重耐药（MDR）细菌的最后防线药物，其通过穿透细菌细胞壁并不可逆结合青霉素结合蛋白（PBPs）发挥杀菌作用。然而，近十年碳青霉烯耐药肠杆菌（CRE）的涌现与传播导致广泛耐药（XDR）甚至全耐药表型，严重威胁公共卫生，尤其在资源有限地区因诊断工具、治疗选项及感染控制基础设施不足而更为严峻。CRE耐药机制主要包括碳青霉酶产生、外排泵过表达及外膜孔蛋白（OMP）突变介导的渗透性降低。碳青霉酶分为Ambler A、B、D三类：A类包括KPC、GES、IMI；B类为金属β-内酰胺酶（MBL），如NDM、IMP、VIM；D类为OXA-48-like酶。这些基因常位于质粒（如IncL/M、IncX3）、整合子及转座子上，导致快速传播。尽管CRE已成为全球问题，非洲国家的流行病学与基因组数据仍存在显著空白。

RESULTS

Bacterial isolates

28株CRE中，肺炎克雷伯菌（60.7%）为主，其次为肠杆菌属（25%）、大肠杆菌（10.7%）及奇异变形杆菌（3.6%）。57.1%为社区获得（CA），42.9%为医院获得（HA）。主要来源于泌尿科（42.9%），尿液样本占57.2%。

Antimicrobial susceptibility

CRE对34种抗菌药物广泛耐药，对厄他培南、亚胺培南、美罗培南耐药率分别为96.4%、60.7%、46.4%。对头孢菌素类耐药率极高（如头孢他啶100%耐药），对青霉素及复合制剂全部耐药。阿米卡星和多黏菌素敏感性较高（71.4%和96.4%），替加环素中度活性（57.1%）。39.3%为XDR，60.7%为MDR。

Carbapenemase and cephalosporinase genes

bla_OXA-48（53.6%）和bla_NDM（35.7%）为主要碳青霉烯酶基因，bla_CMY-1检出率25%。未发现bla_KPC、bla_VIM或bla_OXA-23。7.1%分离株未携带任何碳青霉烯酶基因，且无bla_OXA-48与bla_NDM共携带现象。

Genomic data

两株XDR霍氏肠杆菌（Eh8322_LBHALD和Eh202_LBHALD）经WGS鉴定为ST182型。Eh8322_LBHALD染色体携带多种AMR、金属耐受及毒力基因，其IncL/M质粒（p1_Eh8322_LBHALD）携带bla_OXA-48（位于Tn_1999.2转座子），与越南、西班牙、荷兰及瑞士报道质粒高度同源。另一IncFII(pECLA)质粒（p2_Eh8322_LBHALD）携带生物杀菌剂及金属耐药基因。Eh202_LBHALD的multireplicon质粒（pEh202_LBHALD）携带bla_NDM-5、bla_CTX-M-15及多种其他AMR基因，且与5个国际质粒高度相似。

Phylogenetic analyses

两株菌基因组相似度95.47%（23个SNP差异），与多哥、印度、中国、希腊、哥伦比亚及缅甸的ST182菌株亲缘关系密切，提示克隆传播与近期共同祖先。

DISCUSSION

本研究揭示了达喀尔CRE以肺炎克雷伯菌为主导，高水平耐药性对经验性治疗构成挑战。多黏菌素与阿米卡星仍为有效治疗选项，但需谨慎使用以避免毒性及耐药发展。bla_OXA-48的高流行与全球趋势一致，而bla_NDM的检出警示区域性传播风险。基因组分析证实ST182克隆在西非的扩散，质粒介导的基因水平转移是耐药传播的关键。研究强调需加强感染控制、抗生素管理及基因组监测以遏制CRE传播。

MATERIALS AND METHODS

研究基于2018–2019年达喀尔大学医院生物样本库的28株CRE分离株，经MALDI-TOF MS鉴定，VITEK2系统进行药敏试验，CLSI标准判读结果。DNA提取采用MagMAX试剂盒，PCR检测耐药基因，Illumina MiSeq平台完成WGS，使用SPAdes组装、Prokka注释、CARD/VFDB数据库分析AMR/毒力基因，PLACNETw重构质粒，系统发育分析采用CSIPhylogeny和iTOL。

CONCLUSION

本研究首次系统描绘塞内加尔临床CRE的耐药与基因组特征，重点分析了携带bla_NDM-5和bla_OXA-48的霍氏肠杆菌ST182菌株，强调加强基因组监测对西非地区CRE防控的重要性。