CD47人源化重塑骨髓微环境：MaGIC小鼠模型实现功能性人类中性粒细胞的突破性发展

　　本研究通过构建表达人源CD47、M-CSF（CSF1）、GM-CSF（CSF2）、IL-6和血小板生成素（THPO）的MaGIC（Modified genes for improved human myelopoiesis）小鼠模型，成功解决了人源化小鼠模型中髓系发育不全尤其是功能性中性粒细胞缺失的难题。该模型通过辐照后降低鼠源CD47表达并引入人源CD47信号轴，重塑骨髓微环境，支持人类粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMP）的定植与分化，首次实现了与人原代细胞表型和功能高度一致的人类中性粒细胞（包括趋化、吞噬、活性氧（ROS）产生及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成等核心功能）的体内发育，为感染性疾病、自身免疫病及炎症性疾病的转化研究提供了革命性平台。

　　

Significance

小鼠模型在免疫学研究中有不可或缺的地位，但鼠源与人类免疫系统（尤其在髓系谱系）存在显著差异，限制了其在人类疾病研究中的应用。虽然移植人造血干细胞（HSPC）的人源化小鼠极大促进了人类免疫发育和功能研究，但现有模型仍存在髓系造血功能不全、特别是缺乏功能性人类中性粒细胞等关键局限。本研究团队开发的MaGIC小鼠模型，通过在C57BL/6N背景中引入人源CD47、M-CSF（CSF1）、GM-CSF（CSF2）、IL-6与血小板生成素（THPO），并敲除鼠源Il2rg与Rag1，显著提升了人髓系细胞发育效率，尤其是支持具有完整功能的人类中性粒细胞生成。这些中性粒细胞在表型、发育轨迹和功能（包括趋化性、吞噬作用、产生活性氧及形成中性粒细胞胞外诱捕网）方面均与原代人类细胞高度相似，为人类感染、自身免疫及炎症疾病的研究提供了全新且高度可靠的体内模型。

Abstract

人与小鼠的免疫系统在髓系细胞发育和功能上存在根本差异，尤其体现在中性粒细胞的丰度、寿命及活化特性上。人造血干细胞移植入免疫缺陷小鼠所构建的人源化小鼠，虽被广泛用于人类免疫研究，却长期面临髓系发育不良、缺乏功能性中性粒细胞的问题。本研究报道了命名为MaGIC（Modified genes for improved human myelopoiesis）的人源化小鼠模型。该模型在C57BL/6N背景中整合了人源M-CSF（M）、GM-CSF（G）、IL-6（I）、CD47（C）及THPO，并缺失鼠源Il2rg与Rag1（a）。特别关键的是，在内源性小鼠Cd47启动子控制下表达人CD47，显著促进了异种移植后人中性粒细胞的发育。MaGIC小鼠支持人类骨髓与血液中所有中性粒细胞亚群，其机制在于通过降低鼠CD47并引入人CD47，在辐照后重塑骨髓微环境，为人粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMP）提供了定植优势。此外，该模型还支持单核细胞、组织巨噬细胞、肺泡巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞的发育。功能实验证实，这些人中性粒细胞具备趋化、吞噬、产生活性氧（ROS）及形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的能力。MaGIC模型填补了现有人源化模型的关键空白，极大推动了人类中性粒细胞在感染、自身免疫及炎症疾病中的转化研究。

Humanization of CD47 in Mice Yields More Human Myeloid Cells Compared to Humanization of SIRPA

为构建表达人CD47的小鼠，研究团队通过CRISPR介导的同源定向整合策略，将人CD47编码序列插入小鼠Cd47基因的最后一个外显子，使人CD47得以生理水平表达，同时显著降低鼠CD47的表达。这些小鼠同时整合了人THPO，并置于Rag1^?/? Il2rg^?/?背景（称为C⁴⁷TRG小鼠）。作为对比，表达人SIRPA的小鼠（STRG）是通过同源重组将人SIRPA胞外区编码序列替换小鼠Sirpa基因的相应外显子构建而成。实验发现，C⁴⁷TRG与STRG小鼠均支持人造血细胞移植，但C⁴⁷TRG小鼠表现出更高比例的髓系细胞（CD33⁺），尤其是血液中的CD14⁺单核细胞。更引人注目的是，C⁴⁷TRG小鼠的骨髓和血液中出现了大量CD66b⁺ SSC^high CD33^low细胞，经鉴定为人中性粒细胞，而STRG小鼠中几乎不存在此类细胞。这一发现突破了现有人源化模型缺乏循环人中性粒细胞的瓶颈。

Generation of MaGIC and MISTRGv2 Mice by Humanizing of CSF1, CSF2, and IL6

为全面提升人造血与免疫细胞发育，研究团队在C⁴⁷TRG与STRG基础上进一步引入了人源CSF1（M-CSF）、CSF2（GM-CSF）与IL6，分别构建了MaGIC与MISTRGv2小鼠（C57BL/6N背景）。

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  人源CSF1的引入：通过将人CSF1编码区插入小鼠Csf1基因第二外显子，实现人M-CSF的生理表达，支持了CD16⁺CD14^dim单核细胞亚群、组织巨噬细胞及NK细胞的发育。

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  人源CSF2的构建：利用CRISPR替换策略，将小鼠Csf2基因整体替换为人CSF2转录单元，使人GM-CSF的表达受小鼠启动子调控。该改造支持了人肺泡巨噬细胞在肺部的发育，且在LPS刺激后呈现炎症应答性表达升高。

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  人源IL6的整合：通过类似策略实现人IL6编码区的替换，显著提升了人造血干细胞移植后的造血效率与人免疫细胞在血液中的比例。

Human Immune Cell Lineages in MaGIC and MISTRGv2 Mice

MaGIC与MISTRGv2小鼠均支持高效的人免疫细胞重建，包括T细胞、B细胞、NK细胞及髓系细胞，且小鼠存活时间可达18周以上。关键区别在于，MaGIC小鼠血液中人中性粒细胞比例显著高于MISTRGv2。吉姆萨染色证实，MaGIC小鼠血液中的人中性粒细胞具有典型的分叶核形态。此外，该模型支持来自成人骨髓或胎肝的CD34⁺细胞重建，且人中性粒细胞在各类组织（如肺、肝、脾）中均有分布。值得注意的是，尽管人CD47的表达原本旨在保护鼠红细胞免受人类巨噬细胞吞噬，但实验发现MaGIC小鼠仍出现贫血现象，其机制可能涉及除CD47-SIRPA之外的其他识别信号。

Hematopoiesis in MaGIC Mice

机制研究表明，MaGIC小鼠骨髓中人造血干细胞与祖细胞（HSPC）比例更高，尤其表现为粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMP）的显著扩增。相对应地，鼠源GMP在辐照后出现CD47表达下调，并更易被鼠巨噬细胞吞噬。这一过程可通过表达人SIRPA阻断，证明其依赖CD47-SIRPA的“别吃我”信号轴。在辐照应激下，鼠GMP的CD47表达迅速下降，使其成为巨噬细胞清除的目标，从而为人GMP腾出定植空间。体内外实验均证实，表达人SIRPA可挽救鼠GMP的丢失，并抑制人GMP扩增与人中性粒细胞生成。菌株比较还发现，C57BL/6来源的巨噬细胞对人细胞的吞噬作用低于BALB/c，提示遗传背景对异种细胞互作有重要影响。

Neutrophil Maturation Program and Subsets

通过单细胞转录组分析，研究团队系统刻画了MaGIC小鼠中人中性粒细胞的异质性及其发育轨迹。从人源化小鼠分离的CD66b⁺细胞涵盖从髓系祖细胞到成熟中性粒细胞的全部阶段，其转录组特征与人类Tabula Sapiens数据库中的中性粒细胞高度重叠。Slingshot轨迹分析还原了中性粒细胞从G0（祖细胞状态，高表达CD34、SOX4、MPO）到G5（终末成熟状态，高表达FGL2、IFIT3、ISG15）的完整分化路径。其中，骨髓富含各阶段细胞，而血液与脾脏以G5期细胞为主。脾脏中性粒细胞还表现出IFN-γ应答相关基因特征，反映其组织适应性。此外，体内BrdU脉冲追踪实验显示，人中性粒细胞衰老速度慢于鼠源，CD62L表达下降较缓，进一步印证了物种间中性粒细胞老化动态的差异。

Human Neutrophils from Humanized Mice Are Functional

功能实验充分验证了MaGIC小鼠来源的人中性粒细胞具有与原代人类细胞相当的生理功能：

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  趋化性：在微流体腔室中，该类细胞可高效趋化至IL-8梯度，运动方向性与速度均类同于人源对照；

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  吞噬能力：对pHrodo标记的E.coli颗粒的吞噬效率与人原代中性粒细胞无显著差异；

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  活性氧（ROS）产生：经TNF或PMA刺激后，CellROX检测显示强烈的氧化爆发反应；

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  NETosis：在PMA刺激下可形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），经MPO与瓜氨酸化组蛋白H3（H3Cit）共染色确认。

  这些结果表明，MaGIC小鼠培育的人中性粒细胞在关键功能层面均忠实重现了人类细胞的生物学行为。

Discussion

本研究通过CD47人源化策略，结合多重细胞因子改造，成功创建了支持功能性人中性粒细胞发育的MaGIC小鼠模型。其核心机制在于辐照诱导的鼠GMP CD47下调及随之发生的巨噬细胞清除作用，为人髓系祖细胞腾出定植空间。该模型不仅填补了现有人源化模型缺乏中性粒细胞的空白，还支持单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等多谱系髓系细胞的发育。功能层面，所生成的人中性粒细胞具备趋化、吞噬、产ROS及形成NETs的全部能力，且其转录组特征与原代人类细胞高度一致。尽管在红细胞保护及贫血表型上仍存在挑战，MaGIC模型无疑为人类感染、炎症、自身免疫疾病及癌症免疫研究提供了强大的体内平台，有望显著提升临床前研究的预测价值与转化潜力。