单细胞测序揭示HPV感染早期宫颈鳞癌中PI3+S100A7+角质形成细胞的关键作用及肿瘤微环境调控机制

　　本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，首次在HPV感染相关的早期宫颈鳞状细胞癌（CESC）中发现并鉴定了一类新型的PI3+S100A7+角质形成细胞亚群。该细胞亚群在肿瘤组织中显著富集，与CD163+肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）相互作用，通过激活PI3K-Akt、Wnt和TNF信号通路，协同促进肿瘤进展和免疫微环境重塑。研究还揭示了HPV16与HPV66感染背景下肿瘤微环境（TME）的异质性，为宫颈癌的早期诊断和靶向治疗提供了新视角。

　　

引言

宫颈癌是全球女性第四大常见恶性肿瘤，其中宫颈鳞状细胞癌（CESC）占70%以上，其主要致病因素为高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染。HPV通过早期基因E6和E7致癌蛋白破坏宿主p53和Rb抑癌通路，导致细胞增殖失控和癌前病变。然而，HPV感染本身不足以完全解释肿瘤进展的异质性，肿瘤微环境（TME）中的细胞组成、信号通路和免疫调节在宫颈癌发展中扮演关键角色。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术为解析TME的细胞异质性和分子机制提供了前所未有的分辨率。

方法

患者与样本收集

本研究经新疆医科大学第三附属医院医学伦理委员会批准（K-2021005），纳入4例经病理确诊的早期CESC患者（FIGO分期IB1–IIA1），采集肿瘤组织（T组）和癌旁组织（P组）样本。所有患者签署知情同意书，样本处理符合《赫尔辛基宣言》规范。

单细胞悬液制备与测序

新鲜组织样本经SCelLive保存液处理后，通过机械剪碎和酶解消化获得单细胞悬液，经红细胞裂解和过滤纯化后，使用10x Genomics Chromium平台构建scRNA-seq文库。测序在Illumina Novaseq 6000平台上进行，读长为150 bp双端测序。

数据分析

原始数据经Cell Ranger比对至GRCh38人类参考基因组，质量控制标准为：nCount_RNA >500，nFeature_RNA >200，线粒体基因比例 <25%。后续分析使用Seurat v3.1.2进行标准化、降维和聚类，并通过Harmony算法去除批次效应。细胞类型注释基于CellMarkerDB、PanglaoDB和文献中的经典标记基因。差异表达分析采用Wilcoxon秩和检验，功能富集分析使用clusterProfiler进行GO和KEGG分析。细胞互作分析通过CellPhoneDB v2.1.0和CellChat完成，轨迹推断使用Monocle 2，转录因子活性分析采用SCENIC流程。

实验验证

多重免疫荧光（mIHC）使用Opal 7色试剂盒对石蜡切片进行染色，抗体包括S100A7、PI3、CD68、CD163和HLA-DRA。荧光信号通过TissueFAXS Spectra系统采集，StrataQuest软件进行定量分析。

结果

单细胞转录谱揭示CESC的细胞组成异质性

经质控后共获得77,061个细胞（肿瘤组34,038个，癌旁组43,023个），聚类为20个细胞类型，包括角质形成细胞、成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞等。肿瘤组织中增殖性角质形成细胞显著富集，而基底和上层角质形成细胞主要在癌旁组织中富集。成纤维细胞在癌旁组织中比例更高，提示TME结构重塑。

HPV感染驱动角质形成细胞的转录重编程

HPV阳性样本（3例）中增殖性角质形成细胞比例升高，基底角质形成细胞减少，HPV阴性样本（1例）则呈现相反趋势。HPV16早期基因（E1、E2、E5、E6、E7）和晚期基因（L1、L2）在角质形成细胞中活跃表达，其中E6/E7在分化性角质形成细胞中高表达，提示其干扰正常分化进程。临床标志物p16广泛表达，而exportin-5主要在增殖和分化性角质形成细胞中上调。

PI3⁺S100A7⁺角质形成细胞作为关键肿瘤促进亚群

差异表达分析发现，增殖性角质形成细胞中S100A7、PI3、SPRR3和CNFN显著上调，分化性角质形成细胞中MT2A、NTS和STMN1高表达。功能富集显示，增殖性细胞中TNF信号通路、干扰素α/β反应和抗菌肽通路激活，而分化性细胞中氧化磷酸化和细胞周期通路富集。PI3和S100A7在肿瘤组织中共表达，且与晚期分期和不良预后相关。TCGA数据分析证实，PI3⁺S100A7⁺细胞浸润高的患者总生存期更短（P=0.049）。mIHC验证了该细胞亚群在肿瘤组织中的空间富集。

角质形成细胞分化轨迹与恶性转化

伪时间轨迹分析显示，角质形成细胞从基底状态经分化状态向上层状态演进，但增殖性细胞偏离正常轨迹，与基底和上层细胞均有交互，并激活PI3K-Akt和Wnt通路。基因动态表达显示，S100A7、IL36A等随分化进展上调，而SPINK2、HOXB13等基底标志物下调。

肿瘤相关巨噬细胞通过MIF-CD74轴塑造免疫微环境

巨噬细胞在肿瘤组织中富集，且与增殖性角质形成细胞的互作最强。受体-配体分析显示，CD74-MIF、CD74-COPA和CD74-APP互作主导巨噬细胞通讯网络。CellChat分析证实CD74在巨噬细胞中高表达，激活MIF信号通路。共浸润分析表明，PI3⁺S100A7⁺角质形成细胞与CD163⁺巨噬细胞空间相邻，且两者高浸润患者预后最差（P=0.04）。通路分析提示NF-κB、TNF和细胞因子受体互作通路参与微环境重塑。

成纤维细胞异质性及其促炎作用

成纤维细胞在癌旁组织中更丰富，但肿瘤组织中癌症相关成纤维细胞（CAF）亚群（C1簇）表达α-SMA和POSTN标志物，富集于急性炎症反应通路，提示其通过炎症促进肿瘤进展。

HPV16与HPV66感染的TME差异

HPV16感染样本以增殖性角质形成细胞和细胞毒性CD8⁺ T细胞为主，高表达KLK5、WFDC2和细胞毒性基因（GZMB、PRF1），并激活IL-17和TNF通路。HPV66感染样本则富集成纤维细胞和鳞状上皮细胞，高表达CCN5、APOE和KRT13，提示不同HPV亚型通过 distinct 机制驱动TME异质性。

讨论

本研究通过scRNA-seq技术系统解析了早期CESC的细胞异质性和TME调控网络，首次鉴定出PI3⁺S100A7⁺角质形成细胞这一关键促癌亚群。该细胞与CD163⁺巨噬细胞的空间互作和功能协同，通过激活PI3K-Akt、Wnt和TNF通路，共同促进肿瘤进展和免疫抑制。HPV16和HPV66感染展现出不同的细胞组成和分子特征，提示HPV亚型特异性致病机制。尽管样本量有限且缺乏功能验证，本研究为宫颈癌的早期诊断和靶向治疗提供了新靶点，尤其是针对PI3-S100A7轴和巨噬细胞-角质形成细胞互作的干预策略。

资助与利益冲突

本研究获上海合作组织科技伙伴计划（2020E01056）和天山人才计划（2023TSYCTD0015）支持。作者声明无利益冲突。