H3K9乙酰化依赖的CHAC1转录调控在双氢青蒿素诱导肝星状细胞铁死亡中的作用及机制研究

　　本研究揭示了双氢青蒿素（DHA）通过组蛋白H3K9乙酰化（H3K9ac）修饰激活转录因子ATF4介导的CHAC1基因转录，诱导谷胱甘肽（GSH）代谢紊乱和脂质过氧化，从而驱动肝星状细胞（HSC）铁死亡（ferroptosis）的新机制，为肝纤维化治疗提供了表观遗传调控新靶点。

　　

Introduction

肝纤维化是慢性肝病进展中的常见病理状态，其核心环节是肝星状细胞（HSC）的活化。研究表明，双氢青蒿素（DHA）可通过诱导HSC铁死亡抑制肝纤维化进展。铁死亡是一种铁依赖性脂质过氧化驱动的细胞死亡形式，其特征是谷胱甘肽（GSH）耗竭、脂质活性氧（ROS）积累和GPX4酶活性抑制。CHAC1作为GSH代谢关键酶，可催化GSH降解为5-氧脯氨酸和半胱氨酰甘氨酸，但其在DHA诱导HSC铁死亡中的转录调控机制尚未明确。组蛋白修饰（如H3K9、H3K27、H4K8乙酰化）参与基因表达调控，本研究旨在探索DHA是否通过H3K9乙酰化调控CHAC1转录进而诱导HSC铁死亡。

Methods

研究采用C57BL/6J小鼠构建四氯化碳（CCl₄）诱导的肝纤维化模型，通过腹腔注射DHA（20 mg/kg）及AAV8病毒敲低Chac1或Atf4进行干预。体外实验使用人源HSC-LX2和小鼠原代HSC，通过Western blot、qPCR、免疫荧光、ChIP-qPCR、双荧光素酶报告基因等技术分析蛋白表达、转录调控及表观遗传修饰。铁死亡相关指标通过检测MDA、GSH、铁离子、脂质ROS及GPX4蛋白水平评估。

Results

CHAC1表达在DHA诱导的HSC铁死亡中上调

DHA处理显著抑制HSC活化标志物（α-SMA、COL1A1、FN1），并诱导脂质过氧化（MDA↑）、铁积累（Fe²⁺↑）、ROS生成和GSH耗竭，且铁死亡抑制剂Fer-1可逆转该效应。RNA测序显示CHAC1是DHA处理后上调最显著的基因之一，qPCR、Western blot和免疫荧光证实CHAC1在mRNA和蛋白水平均被DHA剂量依赖性诱导。

CHAC1下调抑制DHA诱导的HSC铁死亡

敲低CHAC1可逆转DHA引起的细胞活力下降、MDA生成、铁积累、ROS上升和GSH耗竭，并恢复GPX4蛋白水平。电镜显示CHAC1缺失阻止DHA诱导的线粒体皱缩和膜密度增加等铁死亡典型形态变化。同时，CHAC1敲低削弱了DHA对HSC活化标志物的抑制作用。

H3K9乙酰化调控CHAC1转录激活

蛋白质和mRNA稳定性实验表明DHA不影响CHAC1半衰期，提示其调控发生于转录层面。DHA处理显著升高组蛋白整体乙酰化水平，尤其是H3K9ac，而乙酰转移酶EP300抑制剂AAC可逆转DHA诱导的CHAC1表达和铁死亡事件。ChIP-qPCR证实DHA特异性增强CHAC1启动子区域的H3K9ac富集，而非H3K27ac或H4K8ac。

ATF4通过结合CHAC1启动子促进其转录

生物信息学分析预测ATF4和CEBPB可能调控CHAC1转录，实验证实仅ATF4敲低显著抑制DHA诱导的CHAC1表达。ATF4缺失减弱DHA引发的铁死亡指标变化，而过表达CHAC1可逆转ATF4敲低对铁死亡的抑制作用。双荧光素酶报告实验显示ATF4结合CHAC1启动子区（-269至-257 bp和-212至-199 bp），突变这些位点显著降低转录活性。

体内抑制CHAC1/ATF4减弱DHA抗纤维化效果

在CCl₄肝纤维化模型中，AAV8介导的Chac1或Atf4敲低可逆转DHA对肝纤维化（胶原沉积、α-SMA表达）和肝功能指标（ALT、AST、ALP、TBIL）的改善作用。组织学检测显示DHA诱导的HSC铁死亡（GSH↓、MDA↑）被敲低策略抑制，且普鲁士蓝染色证实铁沉积特异性发生于纤维瘢痕组织。Western blot显示敲低Chac1/Atf4恢复GPX4表达并削弱DHA对胶原I的抑制。

Discussion

本研究揭示DHA通过上调H3K9ac修饰促进染色质开放，使转录因子ATF4结合CHAC1启动子并驱动其转录，导致GSH降解、GPX4失活和脂质过氧化，最终诱发HSC铁死亡。该机制拓展了DHA抗纤维化的表观遗传调控视角，为靶向CHAC1-H3K9ac轴治疗肝纤维化提供了理论依据。DHA作为安全药物，其临床转化潜力值得进一步探索。