NFIB在雌激素长期处理诱导乳腺癌细胞SOX2表观遗传调控与染色质开放性重塑中的关键作用

　　本研究发现雌激素（E2）通过不同时间尺度调控SOX2表达：短期处理通过降低SRR134增强子染色质开放性（ATAC-seq验证）抑制SOX2转录，而长期处理在维持增强子开放状态的同时通过NFIB介导的表观基因组重塑实现持续抑制。该机制揭示了E2驱动乳腺癌细胞向低侵袭性管腔表型分化的新通路（涉及ER/NFIB协同作用），为激素耐药性乳腺癌中SOX2异常激活提供了表观遗传学解释。

　　

Abstract

雌激素（E2）通过调控多个基因转录参与乳腺祖细胞分化和增殖过程。其中SOX2——一个与干祖细胞相关且在乳腺肿瘤发生中过表达的转录因子——被E2显著下调。为阐明E2介导SOX2抑制的机制，研究团队在乳腺癌细胞中分析了短期和长期E2暴露后的表观基因组和转录组变化。短期E2暴露会降低下游SOX2 SRR134增强子的染色质可及性，从而减少SOX2表达；而长期E2暴露在完全抑制SOX2转录的同时，仍保持SRR124–134增强子簇的可及性，使其处于待激活状态。这种抑制伴随着广泛的表观基因组和转录组变化，与细胞向更分化、更低侵袭性的管腔表型转变相关。最后，研究揭示了转录因子NFIB在该过程中的作用，表明其与雌激素受体协同介导SOX2抑制和全基因组范围的表观基因组可及性变化。

Introduction

雌激素是 mammary 发育两个关键阶段的核心激素：青春期导管伸长阶段和妊娠期分泌性小叶肺泡发育阶段。这些阶段以乳腺祖细胞的剧烈增殖和分化为特征，最终导致乳腺生长和分支形成。乳腺包含两种主要上皮细胞：位于基底膜附近的基底细胞和围绕乳腺中央管腔的管腔细胞。基底层含有对激素不敏感的多能乳腺干细胞，能够再生并形成完整乳腺；而管腔层主要由复制缓慢、完全分化的激素响应性管腔细胞组成。一旦被E2刺激，激素响应性管腔细胞会分泌生长信号诱导附近管腔和基底区室中的细胞复制与分化。

E2主要通过两种核雌激素受体ERα和ERβ发挥作用，其中ERα（ESR1）被认为是乳腺发育和功能的主要受体。E2与ER结合后触发构象变化激活受体转录功能，ER二聚化后作为转录因子与散布在基因组中的雌激素反应元件（ERE）相互作用。这些ER-染色质相互作用需要先锋因子FOXA1，其为ER结合预备调控区域，并对ER转录活性至关重要。有趣的是，E2介导的ER激活主要在管腔细胞中导致基因下调，这一机制依赖于转录抑制子的招募，在顺式调控区域形成复合物以抑制靶基因。

SOX2是乳腺细胞中通常被E2抑制的关键基因。SOX2是在胚胎干细胞中与多能性相关的转录因子，参与将分化细胞重编程为多能状态，并在发育过程中和多个成熟组织的祖细胞中表达。在乳腺中，SOX2主要在青春期前乳腺组织尚未发育完全时表达。随着乳腺发育进展，SOX2在分化上皮细胞中被抑制，表达仅限于乳腺祖细胞中。然而，在乳腺肿瘤发生过程中SOX2异常上调，显示其可增加转移和增殖，并与患者不良预后相关，原因是其维持了肿瘤起始、分化不良的祖细胞。

SOX2上调在激素耐药性乳腺癌细胞发展中也起重要作用。ER+管腔A型乳腺癌通常预后相对较好，因为肿瘤细胞可通过抑制ER致癌效应的激素疗法有效靶向。然而，长期他莫昔芬和氟维司群治疗常导致激素耐药细胞的出现，这些细胞具有更侵袭性表型和独立于E2刺激的独特基因表达模式。这些激素耐药细胞通常失去ER转录活性并显示SOX2过表达。由于SOX2过表达是乳腺癌激素耐药性出现和维持的共同事件，更好理解E2如何在管腔细胞中正常抑制SOX2表达有助于更好靶向对常规疗法耐药的侵袭性肿瘤细胞。

尽管已知E2是SOX2的抑制因子，其潜在分子机制仍 largely 未知。组织和上下文特异性基因表达主要由增强子等顺式调控区域驱动，这些区域可位于与其调控基因相距兆碱基的位置。先前研究显示SOX2在多种癌症（包括管腔乳腺癌）中受下游SRR124–134增强子簇调控。该增强子簇是乳腺癌细胞中SOX2过表达所必需的，因为删除SRR124–134区域会导致SOX2表达严重丧失，继而引起转录组和表观组改变。SRR124和134增强子的转录活性被NFIB抑制，NFIB是MCF-7细胞中SOX2的上游抑制因子。本研究发现在E2介导的SOX2抑制中，SRR124–134增强子簇存在时间差异性机制：短期E2暴露导致SRR124和SRR134转录抑制，伴随独立于ER模体的SRR134增强子活性降低和染色质可及性减少；而长期E2暴露通过不同机制导致严重SOX2下调，SRR124–134簇保持转录抑制但可及性和待激活状态得以维持。研究还确定与SOX2下调相伴，长期E2暴露导致转录组重编程，与乳腺癌细胞向更低侵袭和增殖性管腔表型转变相关，并引发全局更开放的、由NFI家族模体处染色质重塑驱动的表观基因组。

Materials and methods

Cell culture

MCF-7细胞来自多伦多总医院研究所，T47D细胞购自ATCC。细胞在E2剥夺条件下培养，使用无酚红DMEM高糖培养基，添加5%活性炭剥离FBS、谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素-链霉素、非必需氨基酸、HEPES和胰岛素。细胞每3天传代或更换培养基。

Estrogen treatment

细胞培养基中添加10 nmol/L β-雌二醇（溶于DMSO）进行雌激素处理。为消除其他来源的E2，细胞在活性炭剥离FBS（E2 < 0.01 nmol/L）中生长。短期E2暴露细胞在10 nmol/L β-雌二醇中维持48小时，每天更换培养基；长期E2暴露细胞在相同浓度E2中培养至少一年，每3天换液。长期E2处理细胞进行E2剥夺时，用PBS清洗3次后铺板于E2剥夺培养基中，之后每天更换新鲜培养基。

Luciferase assay

荧光素酶活性使用双荧光素酶报告 assay 检测。将空pGL4.23载体（含最小启动子minP）与SRR124、SRR134、SRR1、SRR2、hSCR和PGR ERE等区域PCR扩增后插入NotI位点。使用JASPAR2022识别SRR134序列中ER模体（AGGTCACnnTGACCT），对得分80%以上的模体进行突变直至得分低于80%而不影响共存模体或创建新结合位点。E2剥夺细胞铺板于96孔板，24小时后更换含E2或对照培养基，4小时后转染增强子载体与pGL4.75混合物（比例50:1），48小时后裂解细胞检测荧光素酶活性。

Transcriptome analysis

从LT ? E2、48 h + E2和LT + E2细胞中提取总RNA，经Turbo DNase消化基因组DNA后，用随机引物进行逆转录反应。cDNA稀释后使用SYBR Select Mix进行qPCR反应（引物见附表），基因表达归一化至PUM1。总RNA送至测序中心进行配对末端rRNA去除RNA-seq（Illumina 2500, 125 bp）。读数经fastQC质控、fastP修剪后使用STAR 2.7映射到人类基因组（GRCh38/hg38）。映射读数用featureCounts量化，导入DESeq2进行归一化和差异表达分析。|log₂ FC| > 1且FDR调整Q < 0.01的基因视为显著变化。使用EnhancedVolcano包绘制差异基因表达火山图，pheatmap R包绘制相关性和聚类热图。GSEA通过按log₂ FC排名基因，使用clusterProfiler包GSEA函数分析，阈值FDR调整Q < 0.05，MSigDB GO术语数据库包含表达特征（C2）和生物过程（C5）。

Chromatin accessibility analysis

细胞在三独立孔中培养（n=3），5万细胞送至测序中心使用Omni-ATAC protocol制备ATAC-seq文库。文库在Illumina Novaseq 6000平台上以50 bp配对末端参数测序。读数经fastQC质控、fastP修剪后使用STAR 2.7映射到人类基因组。使用Genrich调用narrowPeak，diffBind进行差异染色质可及性分析。|log₂ FC| > 1且FDR调整Q < 0.01的ATAC-seq峰视为显著变化。在PGR（PGR ERE）、OR5K1（pOR5K1）和SOX2（pSOX2）启动子以及SRR1、SRR2、SRR124、SRR134、hSCR和荒漠区域，以各区域核心为中心1500 bp窗口计算ATAC-seq信号。读数归一化至文库大小（RPM）并转换为log₂尺度（log₂ RPM），各区域平均log₂ RPM与OR5K1启动子比较，使用Dunn's test与Holm校正进行差异分析。使用TOBIAS进行转录因子足迹分析，标准设置下|log₂ FC| > 0.1且FDR调整Q < 0.01的模体视为在各条件下显著富集。各条件重复样本（n=3）合并为单个BAM文件，ATAC-seq峰使用ChIPpeakAnno分配至启动子±1 Mb内最近基因。

ChIP-seq analysis

从ENCODE等获取转录因子ChIP-seq数据。使用ChIPpeakAnno分析重叠ChIP-seq峰，通过比较重叠峰数与基因组总大小除以峰中位尺寸进行超几何检验。在PGR（PGR ERE）、OR5K1（pOR5K1）和SOX2（pSOX2）启动子以及SRR1、SRR2、SRR124、SRR134、hSCR和荒漠区域，以各区域核心为中心1500 bp窗口计算ChIP-seq信号。读数归一化至文库大小（RPM）并转换为log₂尺度（log₂ RPM），各区域平均log₂ RPM与OR5K1启动子比较，使用Dunn's test与Holm校正进行差异分析。

Cell proliferation assay

细胞以每孔1000细胞密度接种于96孔板，含100 μL E2剥夺或E2处理培养基。培养1、2、4、6或10天后，与10 μL WST-1增殖试剂孵育4小时，测量440 nm吸光度并归一化至仅含培养基的背景对照。相对吸光度值与第1天比较以控制接种浓度差异。

Cell migration assay

细胞胰蛋白酶消化，PBS洗涤后重悬于无FBS无酚红DMEM中。将15000细胞种于24孔板transwell PET膜上室，下室添加含5%活性炭剥离FBS的酚红-free DMEM作为趋化剂。接种6天后膜用3.7%多聚甲醛固定，结晶紫染色，PBS洗涤后手动计数迁移细胞。

Results

Short-term E2 exposure downregulates SRR134 enhancer activity

E2暴露可下调ER+乳腺癌细胞中SOX2转录。为更好理解该抑制机制，研究使用MCF-7和T47D两种ER+管腔A乳腺癌腺癌模型。细胞长期维持于E2剥夺条件（LT ? E2）至少一年，使用无酚红DMEM加活性炭剥离FBS培养基。此条件下RNA-seq显示SOX2 RNA水平处于所有表达基因前10%。重新引入10 nmol/L β-雌二醇后，基因表达与E2剥夺细胞比较。作为阳性对照，检测孕激素受体基因（PGR）表达——一个已知E2下游靶标。如预期，24小时E2给药后PGR表达显著上调（log₂ FC > 1, P < 0.001, Tukey's HSD test），确认细胞在长期E2剥夺后仍保持E2响应性。SOX2在MCF-7和T47D细胞中通常高表达，但24小时E2暴露后两细胞系均显示SOX2表达显著下调（P < 0.001）。MCF-7细胞中SOX2表达在初始E2暴露48小时后达最低水平，较E2剥夺条件表达降低约3倍，该抑制直至96小时保持稳定；T47D细胞则显示持续渐进性SOX2下调直至96小时，初始E2暴露后表达降低约10倍。

接下来研究E2介导SOX2抑制的表观遗传机制。先前研究表明SOX2转录受下游增强子簇调控，包含SRR124和SRR134两个调控区域，在乳腺癌和肺癌中驱动SOX2过表达。有趣的是，发现与SOX2相伴，SRR124和SRR134的eRNA表达在MCF-7（SRR124 log₂ FC = ?0.98; SRR134 log₂ FC = ?1.34）和T47D（SRR124 log₂ FC = ?1.17; SRR134 log₂ FC = ?1.37）细胞中48小时E2（48 h + E2）暴露后显著（P < 0.001）降低。为验证短期E2暴露是否直接影响增强子活性，使用含萤火虫荧光素酶基因（受最小启动子minP控制）的报告载体评估SRR124和SRR134活性。同时测试了胚胎增强子SRR1、SRR2和hSCR（先前显示在乳腺癌中缺乏增强子活性）以及作为E2活性阳性对照的PGR ERE活性。48小时E2暴露后，较强SRR134增强子活性在MCF-7（log₂ FC = ?1.80）和T47D（log₂ FC = ?0.73）细胞中显著（P < 0.001, Dunnet's test）降低；相反，PGR ERE活性如预期在两细胞系中显著增加。这些数据表明短期E2暴露通过抑制SRR134增强子活性下调SOX2表达。

基于E2驱动SOX2下调可能源于SRR124–134增强子簇染色质可及性降低的假设，研究团队使用ATAC-seq检测了LT ? E2和48 h + E2 MCF-7细胞中SOX2位点可及性变化。发现短期E2暴露导致较强SRR134增强子染色质可及性约2倍降低（P = 0.027, Dunnet's test），与阴性对照基因组区域（嗅觉基因OR5K1启动子pOR5K1）比较。SRR124可及性降低较小（log₂ FC = ?0.80, P = 0.22），SOX2启动子（pSOX2）可及性中度降低（log₂ FC = ?0.78, P = 0.24）。如预期，短期E2暴露显著增加（log₂ FC = 0.69, P = 0.048）阳性对照PGR ERE处染色质可及性。这些结果证明SRR134增强子染色质可及性在短期E2暴露的MCF-7细胞中被抑制，为E2驱动乳腺细胞SOX2表达抑制提供了表观遗传机制。

研究团队感兴趣E2对SOX2表达的抑制效应是否源于ER在SRR124–134簇的结合。短期E2处理下ER ChIP-seq分析显示SOX2基因周围ER结合最多区域是SRR134，在MCF-7（log₂ RPM = 2.24, P < 0.001, Dunnet's test）和T47D（log₂ RPM = 0.96, P = 0.002）细胞中与pOR5K1比较均显著富集。SRR124在MCF-7中也显示显著ER结合富集，但程度低于SRR134，与先前发现SRSR134增强子比SRR124活性更强一致。两细胞系SOX2启动子内均未观察到显著结合，表明ER主要结合远端SRR134增强子以抑制SOX2。接下来使用JASPAR模体数据库识别并精确突变SRR134序列内ER模体（AGGTCACnnTGACCT），而不引入额外转录因子结合模体。出乎意料，ER模体突变并未消除（P = 0.79）E2对SRR134活性的抑制效应。这表明雌激素抑制在SRR134增强子可能也独立于该ER模体作用，ER可能通过其他转录因子招募至SRR134以抑制增强子活性，这可能通过直接蛋白-蛋白相互作用或间接调节这些因子表达发生。

Long-term E2 exposure abolishes SOX2 expression

评估短期E2暴露对SOX2转录抑制效应后，研究团队质疑该机制是雌激素刺激的短期适应反应，还是细胞在持续E2暴露后进一步抑制SOX2转录。为回答该问题，将MCF-7和T47D细胞在长期E2暴露（LT + E2）条件下培养超过一年。与E2剥夺条件比较，LT + E2 MCF-7显示严重约180倍降低（P < 0.001, Tukey's HSD test）的SOX2表达，而LT + E2 T47D细胞显示更适度但仍显著约14倍降低（P < 0.001）。进一步在蛋白水平检测该抑制，显示MCF-7细胞与小鼠胚胎干细胞一样有 substantial SOX2蛋白水平，该水平在E2缺失时持续但在LT + E2中未检测到。LT + E2对SOX2的下调在MCF-7细胞中如此深刻，其与SRR124–134纯合增强子簇删除（ΔENH^?/?）中SOX2蛋白损失相当。这表明连续E2暴露严重抑制乳腺癌细胞中SOX2表达。

接下来假设类似SOX2表达，SRR124和SRR134周围eRNA转录可能被长期E2暴露抑制。SRR124和SRR134 eRNA转录确实在长期E2暴露的MCF-7（SRR124 log₂ FC = ?5.37; SRR134 log₂ FC = ?5.21）和T47D（SRR124 log₂ FC = ?5.79; SRR134 log₂ FC = ?5.94）细胞中显著（P < 0.001）降低超过30倍。然而发现尽管SOX2表达和SRR134 eRNA转录在LT + E2 MCF-7细胞中几乎消除，质粒背景中SRR134增强子活性仍显著高于（FC = 3.02, P < 0.001, Tukey's HSD test）minP且与48小时E2暴露后观察到的活性水平相似（P = 0.19）。SRR134在长期E2暴露后无法驱动基因组中eRNA转录与报告质粒上保持增强子活性之间的 disconnect——报告质粒不获得完整核小体阵列——表明存在染色质-based 增强子抑制机制。为此研究团队调查了LT + E2 MCF-7细胞中SOX2基因周围染色质可及性变化。pSOX2处可及性确实在LT + E2相比LT ? E2 MCF-7细胞中显著降低（P = 0.004）。然而pSOX2可及性降低与SRR124–134簇染色质可及性变化解耦，因为SRR124（P = 0.85, Tukey's HSD test）和SRR134（P = 0.98）在长期E2暴露后均未显示类似可及性降低。事实上，48 h + E2时SRR134观察到的可及性降低在长期E2暴露后未保持。这表明短期E2暴露通过抑制SRR134可及性和活性下调SOX2，而长期E2暴露进一步抑制SOX2和SRR124–134簇转录同时染色质保持可及。

研究团队推论SRR124–134簇染色质可及性在LT + E2细胞中的维持可能允许SOX2表达在E2抑制效应移除后重新激活。确实，从LT + E2 MCF-7细胞撤除E2增加SOX2抑制，SOX2转录水平在48小时E2剥夺后显著增加（P < 0.001, Tukey's HSD test）超过2倍。这表明尽管SOX2表达受连续E2暴露严重影响，SRR124–134增强子簇仍处于待激活状态，一旦E2抑制效应移除即可 jumpstart SOX2转录。

Long-term E2 exposure reprograms the transcriptome of MCF-7 cells

长期E2暴露导致严重SOX2下调，研究团队感兴趣什么其他表型和分子适应源于连续E2暴露。明场显微镜检查显示长期E2暴露导致MCF-7细胞相比长期E2剥夺发生形态学变化。LT ? E2 MCF-7细胞呈纺锤样形态，作为伸长细胞生长具膜突起，不形成集落，稀疏生长彼此分离；LT + E2 MCF-7细胞有更密集平滑集落。转录组水平，RNA-seq分析显示基因表达模式 massive 变化，4154基因在长期E2暴露条件相比长期E2剥夺显著变化（|log₂ FC > 1|, FDR调整Q < 0.01）。其中2117基因（51%）在LT + E2 MCF-7细胞中下调，2037基因（49%）上调。SOX2是长期E2暴露中最显著（log₂ FC = ?6.95, Q = 8.01 × 10^–235）下调基因之一，而经典E2响应基因GREB1（log₂ FC = 6.17, Q < 1 × 10^–300）是最显著上调基因之一。

LT + E2 MCF-7细胞中基因集富集分析（GSEA）显示显著（FDR调整Q < 0.05）富集（归一化富集得分NES > 1）与上皮分化（NES = 1.42; FDR调整Q = 0.02）、管腔A乳腺癌中上调基因（NES = 1.91, Q = 5.68 × 10^–3）和侵袭性乳腺癌中下调基因（NES = 2.05, Q = 5.85 × 10^–5）相关通路。由于ER+管腔A乳腺癌通常相比其他乳腺癌类型具有良好分化非侵袭性表型，这表明连续E2暴露维持管腔样表型，而E2剥夺增加侵袭特性。为确认细胞在长期E2暴露下是否显示更低复制，比较LT + E2和LT ? E2 MCF-7细胞间增殖速率，发现长期E2暴露显著（P < 0.001, 双尾t检验）降低细胞复制速率相比长期E2剥夺。细胞迁移实验通过监测细胞通过PET膜运动调查细胞侵袭和移动性，显示LT + E2 MCF-7细胞相比LT ? E2 MCF-7细胞迁移速率显著（P < 0.001）降低约9倍。这些数据表明连续E2暴露使细胞向更分化管腔转录程序 commitment，下调SOX2，减少细胞复制并抑制迁移能力相比长期E2剥夺。

Long-term E2 exposure reshapes the epigenome landscape of MCF-7 cells with the help of NFIB

为调查E2暴露对MCF-7细胞表观基因组效应，研究团队进行ATAC-seq并比较48小时或LT E2处理後染色质可及性。发现LT + E2 MCF-7细胞表观基因组 profound 变化，41097区域显示显著变化（|log₂ FC > 1|, FDR调整Q < 0.01）相比LT ? E2 MCF-7细胞。这些区域大多数（75%, 30764区域）在LT + E2 MCF-7细胞中变得更可及（log₂ FC > 1），表明连续E2暴露重编程MCF-7细胞表观基因组至 increased 染色质可及性状态。相反，48小时E2后变化较不 pronounced（9525 |log₂ FC > 1|, FDR调整Q < 0.01），尽管约40%这些区域与LT + E2处理细胞中显著变化区域重叠。

接下来使用TOBIAS分析开放染色质区域内转录因子足迹 differential 富集。识别355和262模体具有显著（|log₂ FC > 0.1|, FDR调整Q < 0.01） differential 结合得分在48小时或LT + E2细胞中相比LT ? E2细胞。与观察到SOX2表达损失一致，SOX2结合模体显示可及性显著减少在48小时（log₂ FC = ?0.15, FDR调整Q = 8.12 × 10^–134）和LT + E2细胞（log₂ FC = ?0.21, FDR调整Q = 1.33 × 10^–150）。在122个可及模体中显著 overrepresented 在LT + E2 MCF-7细胞，ER模体如预期高度富集（ESR2, log₂ FC = 0.16, FDR调整Q = 1.07 × 10^–140; ESR1, log₂ FC = 0.12, FDR调整Q = 4.99 × 10^–122）；然而发现长期E2治疗后最富集模体属于NFI转录因子家族：NFIX（log₂ FC = 0.38, FDR调整Q = 4.73 × 10^–179）、NFIC（log₂ FC = 0.37, Q = 1.50 × 10^–