α-羟基丁酸通过多数据库挖掘与机器学习调控脓毒症进展：关键靶点与生物标志物的发现

　　本综述通过多数据库数据挖掘（SEA、SuperPred、SwissTargetPrediction）、机器学习（LASSO、RF、SVM）及无监督聚类分析，系统揭示了肠道菌群代谢物α-羟基丁酸（α-HB）在脓毒症中的调控作用。研究鉴定出42个α-HB相关靶点，发现其显著富集于免疫应答、缺氧及癌症通路，并筛选出APEX1、CTSD、SLC40A1、PIK3CB四个关键生物标志物。分子对接证实α-HB与这些靶点存在潜在相互作用，脓毒症亚型分析进一步揭示其与免疫细胞浸润及患者生存状态的显著关联，为脓毒症的机制研究和靶向治疗提供新方向。

　　

背景

脓毒症仍是全球发病率和死亡率居高不下的重要原因，其定义为机体对感染产生失调的免疫反应，进而引发全身性炎症、多器官功能障碍，并常常导致死亡。尽管临床管理取得了显著进展，但脓毒症的早期诊断和有效治疗策略仍极具挑战性。近年来的研究强调了肠道菌群及其代谢物在调节宿主免疫反应、影响脓毒症发生和发展中的重要性。在众多代谢物中，α-羟基丁酸（α-HB）作为一种短链有机酸，既由肠道微生物代谢产生，也来源于氨基酸分解代谢，并与氧化应激相关，已成为调节炎症和免疫应答的潜在关键分子。α-HB与脓毒症的发病以及28天死亡率显著相关，然而，关于其在脓毒症期间全身水平的具体变化和生理浓度范围的全面数据仍较为有限。此外，α-HB影响脓毒症进展的分子机制仍不清楚，其确切的治疗潜力和病理生理学意义需进一步阐明。

方法

本研究的数据来源于基因表达综合（GEO）数据库，主要数据集GSE26440包含32个健康对照样本和98个脓毒症样本，另使用GSE13904、GSE26378、GSE9692、GSE8121和GSE4607等多个数据集进行验证。原始数据经过R语言处理，包括背景校正、标准化和汇总，采用RMA方法进行标准化，并利用sva包中的Combat函数校正批次效应。

α-HB相关靶点通过三个数据库进行识别：SEA、SuperPred和SwissTargetPrediction。在SwissTargetPrediction中，概率大于10%的靶点被纳入；SuperPred中概率大于50%的靶点被纳入；SEA中p值小于0.05的靶点被纳入。通过整合GSE26440数据集的脓毒症相关差异表达基因（DEGs），筛选出42个α-HB与脓毒症的共同靶点。

研究采用热图和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析可视化这些靶点的表达模式和相互作用。功能富集分析包括基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，使用clusterProfiler R包，以调整后p值小于0.05为阈值。

机器学习方法用于生物标志物识别，包括LASSO回归（glmnet包）、随机森林（RF；randomForest包）和支持向量机（SVM；e1071包）。模型性能通过AUC、敏感性、特异性等指标评估。基于四个关键生物标志物（APEX1、CTSD、SLC40A1、PIK3CB）构建列线图（Nomogram）预测脓毒症风险，并通过ROC曲线、校准曲线和决策曲线分析（DCA）验证其预测准确性和临床效用。

脓毒症亚型分析采用ConsensusClusterPlus包进行无监督聚类，主成分分析（PCA）可视化亚型分离。差异表达基因进行GO和KEGG富集分析，以揭示各亚型涉及的生物学过程和通路。基因集变异分析（GSVA）和单样本基因集富集分析（ssGSEA）分别用于评估通路活性和免疫细胞浸润差异。

分子对接研究使用AutoDock Vina进行，探讨α-HB与四个关键靶点（APEX1、CTSD、SLC40A1、PIK3CB）的相互作用。蛋白质结构从蛋白质数据库（PDB）获取，配体结构从PubChem数据库下载，对接结果基于结合亲和力评分进行分析。

结果

α-HB相关靶点与脓毒症共同靶点的识别

通过多数据库挖掘，共识别出95个α-HB相关靶点。从GSE26440数据集中鉴定出8,986个脓毒症相关差异表达基因，其与α-HB靶点取交集后，获得42个共同靶点。热图分析显示这些靶点在正常和脓毒症组中表达模式显著不同，PPI网络揭示了这些靶点之间的潜在生物学相互作用和通路。

功能富集分析

GO富集分析显示，这些靶点显著富集于生物学过程如细胞对缺氧的反应、活性氧物种代谢过程的调节，分子功能如p53结合、磷酸酪氨酸残基结合，以及细胞组分如核染色体、基底外侧质膜。KEGG通路分析表明，这些靶点显著富集于PD-L1表达与PD-1检查点通路、HIF-1信号通路、鞘脂信号通路等与免疫应答和癌症相关的通路。

机器学习识别生物标志物

通过LASSO、RF和SVM三种机器学习算法，最终筛选出四个关键生物标志物：APEX1、CTSD、SLC40A1和PIK3CB。这些基因在脓毒症患者中表达显著改变，且在多个独立数据集中验证了其诊断性能，AUC值均较高，表明其作为脓毒症生物标志物的稳健性。

列线图构建与验证

基于上述四个基因构建的列线图在预测脓毒症风险方面表现出高准确性，AUC为0.948。校准曲线显示预测概率与实际结果之间具有良好一致性，DCA分析表明该列线图在临床决策中具有较高的净收益。

脓毒症亚型分析

基于42个α-HB靶点的表达谱，脓毒症患者被分为两个明显亚型：HB亚型1和HB亚型2。PCA分析证实了两亚型之间的分离。生存状态分析显示，HB亚型1主要与非存活者相关，而HB亚型2更多见于存活者，两者生存状态差异显著。差异表达基因的GO和KEGG富集分析揭示，两亚型在免疫应答调节信号通路、细胞因子产生调节、巨噬细胞活化等生物学过程以及破骨细胞分化、细胞因子-细胞因子受体相互作用、NOD样受体信号通路等通路上存在显著富集。

通路活性和免疫细胞浸润分析

GSVA分析显示，HB亚型2在多种免疫和炎症通路中显著富集，如调节对肿瘤细胞的反应、突触小泡定位以及多种白细胞介素介导的信号通路（如IL-6、IL-4、IL-2、IL-15）。ssGSEA分析表明，HB亚型1中树突状细胞（DC）、调节性T细胞（Tregs）、自然杀伤细胞（NK细胞）等免疫细胞浸润水平较高，而HB亚型2中中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润更为显著。

分子对接分析

分子对接结果显示，α-HB与APEX1、CTSD、SLC40A1和PIK3CB均存在潜在相互作用，Vina评分介于-4.1至-4.8之间。对接模型揭示了氢键和疏水相互作用等关键结合模式，为α-HB影响这些靶点功能的分子机制提供了初步解释。

讨论

本研究结果提供了关于α-HB在脓毒症中作用的新见解，揭示了其通过调节免疫应答、氧化应激和细胞信号通路影响疾病进展的潜在机制。功能富集分析强调了α-HB与缺氧反应、ROS代谢和免疫受体活性等关键生物学过程的关联，这与脓毒症的病理生理特征高度一致。KEGG通路分析进一步表明，α-HB可能通过调节PD-1/PD-L1、HIF-1和鞘脂信号通路等影响脓毒症的免疫和炎症反应。

机器学习方法筛选出的APEX1、CTSD、SLC40A1和PIK3CB四个生物标志物，在多个数据集中均表现出良好的诊断性能，有望用于脓毒症的早期识别和风险分层。脓毒症亚型分析揭示了α-HB相关靶点表达谱的异质性，其中HB亚型1和HB亚型2在免疫细胞浸润、通路活性和临床结局方面存在显著差异，这为脓毒症的精准分型和个体化治疗提供了依据。

分子对接结果提示α-HB可能与上述关键靶点直接相互作用，从而影响其功能，但结合亲和力相对较弱，表明这些相互作用可能为间接或需进一步实验验证。未来的研究应通过体外和体内实验确认这些互作的生物学意义，并探索α-HB作为治疗靶点的潜力。

研究的局限性包括其相关性分析性质，无法确立因果关系，且缺乏实验验证和临床参数（如SOFA评分）的全面整合。此外，研究依赖特定数据集，结果的外推性需进一步验证。未来的工作应扩大样本规模，结合多组学数据和功能性实验，深入阐明α-HB在脓毒症中的具体作用机制和临床转化价值。

结论

本研究通过整合多数据库挖掘、机器学习和无监督聚类分析，系统揭示了α-HB在脓毒症中的调控作用，鉴定出关键靶点和生物标志物，并发现其与免疫细胞浸润和患者生存状态的关联。这些发现为脓毒症的机制解析和精准治疗提供了新视角，未来的研究应聚焦于α-HB相关靶点的功能验证和靶向策略的开发，以改善脓毒症的临床管理。