BceAB型转运蛋白胞外结构域（ECD）结合杆菌肽的机制研究及其在新型抗菌肽识别与分类中的应用

　　本综述深入探讨了BceAB型ABC转运蛋白家族成员SaNSrFP的胞外结构域（ECD）与杆菌肽（bacitracin）的特异性结合机制及其功能意义。研究通过体外ATP酶活性测定、分子对接和结构比对，揭示了ECD在底物识别和信号转导中的核心作用，并首次基于ECD结构折叠对该超家族进行了系统性分类，为理解细菌耐药性（如对Zn-bacitracin的抵抗）和开发新型抗菌策略提供了重要理论依据。

　　

1 引言

革兰阳性细菌的肽聚糖作为第一道渗透屏障，其合成中间体是抗菌化合物（如肽抗生素尼生素和杆菌肽）的常见靶点。人类病原菌中存在的基因簇可通过上调表达来赋予对这些化合物的抗性。在无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）中发现的一个此类基因簇编码一种杆菌肽外排（BceAB）型ATP结合盒转运蛋白SaNsrFP及其相关的双组分系统SaNsrRK。SaNsrFP在体内对多种抗菌肽具有抗性，其中对杆菌肽的活性最高。与其他BceAB型ABC转运蛋白类似，SaNsrFP具有一个大的胞外结构域（ECD），该结构域决定了其底物谱。

2 材料与方法

本研究通过异源表达和纯化SaNsrFP复合体，测量其在存在和缺乏杆菌肽条件下的ATP酶活性，发现杆菌肽的结合变构调节ATP酶活性。通过表达和纯化SaNsrP的可溶性ECD，利用两种体外结合试验证明该片段单独负责杆菌肽结合，并通过分子对接探索了其结合机制。此外，利用AlphaFold数据库评估了24个BceAB型ABC转运蛋白ECD的结构保守性，首次基于ECD的结构折叠对该超家族进行了分类。

3 结果

3.1 SaNsrFP的体外表征

纯化的SaNsrFP在LMNG胶束中显示出典型的ATP酶动力学，最大活性（B_max）为113 ± 28 nmol/min/mg，K_D为5.2 ± 2.0 mM。添加100 μM杆菌肽后，B_max增至127 ± 8.2 nmol/min/mg，K_D降至1.7 ± 0.32 mM，表明杆菌肽诱导了ATP的正协同结合。ATP酶缺陷突变体SaNsrF_H202AP仅显示边际活性，证实观察到的活性直接与SaNsrFP相关。

3.2 SaNsrP ECD的体外表征

纯化的ECD在溶液中为单体，分子量为25.8 kDa。通过多角度光散射（MALS）和酪氨酸荧光淬灭实验，证实ECD与杆菌肽结合，Zn-杆菌肽的K_D为259 ± 65.0 μM，杆菌肽的K_D为304 ± 15.7 μM。这一结合亲和力显著低于全长BceAB转运蛋白（60 nM），可能与缺乏跨膜域和脂质环境有关。

3.3 杆菌肽与SaNsrP ECD结合的分子建模预测

分子对接揭示了两种主要结合取向：杆菌肽的大环环位于ECD中央裂隙或N末端位于中央裂隙。后者在结合能上更有利。分子动力学模拟显示，大环环在中央裂隙时结合更稳定，而N末端波动较大。密度分析表明，大环环优先位于SABRE亚结构域附近的疏水区域，而N末端则靠近富含极性氨基酸的Porter亚结构域。

3.4 其他BceAB型转运蛋白的结构识别

通过AlphaFold数据库的结构比对，发现BceAB型转运蛋白在厚壁菌门中广泛存在。尽管序列保守性低，但所有BceB的跨膜域结构保守，而ECD则呈现多种结构。这些ECD可根据结构特征分为五组，每组具有特定的二级结构插入，可能影响底物识别和信号转导。

3.5 ECD的结构比对揭示五组 distinct 类别

ECD的序列同一性低于整个BceB，但结构比对显示五组ECD具有较低的RMSD（<2.5 ?）。所有ECD均保守两个β链连接SABRE和Porter亚结构域，Porter亚结构域由两个保守β片和两个α螺旋组成，SABRE亚结构域包含三个β链、一个β-β环和一个保守α螺旋。组特异性二级结构元素可分为三类：参与结合界面形成的α螺旋和无规环、与跨膜域相互作用的元素以及扩展ECD形状但不影响结合位点的元素。

4 讨论

近期研究表明，表达SaNsrFP的乳酸乳球菌NZ9000细胞对杆菌肽具有最高抗性，而对尼生素等阳离子抗菌肽的抗性较低。这种抗性机制可能涉及直接结合杆菌肽或屏蔽其靶点UPP，为细胞重建肽聚糖层提供时间。本研究通过体外实验证实SaNsrFP的ATP酶活性受杆菌肽刺激，表现为协同性增加和K_D降低，这与肺炎链球菌BceAB的研究一致，但不同于枯草芽孢杆菌BceAB的ATP酶抑制现象。

ECD交换实验表明，ECD决定底物特异性。本研究成功纯化SaNsrP ECD并证实其单独结合杆菌肽，结合亲和力为微摩尔级。分子对接和MD模拟提示两种结合取向，可能反映了ECD对多种肽底物的适应性或其在催化循环中的不同作用方式。

通过结构比对，本研究首次将BceAB型转运蛋白ECD分为五组，揭示了保守核心结构和组特异性元素。这些元素可能限制结合界面体积，从而影响底物识别范围，而特定序列则负责底物相互作用和结合界面电荷调节。尽管部分BceAB的抗性数据有限，但现有数据表明它们对LL-37和杆菌肽具有响应性，且ECD形状可能通过限制结合容积调控底物谱，而序列则精细调节特异性。

总之，BceAB型转运蛋白如SaNsrFP在临床相关病原菌和非病原菌中保守存在。本研究证实其ECD结合杆菌肽，并通过结构分类为理解细菌耐药性和开发新型抗菌策略提供了基础。未来需更多功能数据、体外结合实验和底物结合结构来推进这一分类。