尼可地尔通过降低活性氧积累削弱多黏菌素E对肺炎克雷伯菌的抗菌效力

　　本研究揭示尼可地尔（NO供体）通过释放一氧化氮（NO）减少多黏菌素E（Polymyxin E）诱导的活性氧（ROS）积累，从而削弱其对抗多重耐药肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）的杀菌效果。体内外实验证实该拮抗作用，提示临床联合用药需警惕抗菌效能降低风险。

　　

1 引言

多黏菌素E（Polymyxin E，又称黏菌素）是治疗多重耐药革兰阴性菌感染的最后一道关键防线。随着碳青霉烯类耐药菌株的日益增多，临床治疗选择愈发受限。近年来，多黏菌素E在治疗碳青霉烯耐药和多重耐药肺炎克雷伯菌引起的多系统感染中广泛应用，但其疗效逐渐下降，并导致了多黏菌素E耐药革兰阴性病原体的出现。

多黏菌素等杀菌性抗生素通过产生活性氧（ROS）导致细胞死亡。一氧化氮（NO）由细菌一氧化氮合酶（bNOS）或供体（如MAHMA NONOate）产生，能增强细菌的抗生素耐药性，帮助其存活。NO介导的耐药机制涉及减轻多种抗生素引起的氧化应激，这表明抑制bNOS活性可能增强抗菌治疗效果。先前的研究表明，一些bNOS抑制剂能够增强抗菌药物的效力。

耐药性的发展部分归因于联合用药方案中可能存在的拮抗作用。拮抗机制涉及减轻氧化应激反应，如多索茶碱和姜黄素等药物能降低抗菌剂诱导的ROS水平，从而削弱抗生素的杀菌效果。这些结果提示临床联合用药需谨慎。研究表明，NO能增强细菌对多种抗生素的耐药性，如β-内酰胺类抗生素和氨基糖苷类。一些研究提出，NO介导的耐药是通过激活过氧化氢酶影响氧化应激来实现的。多黏菌素E被认为是治疗多重耐药肺炎克雷伯菌感染的最后手段，但目前缺乏研究探讨NO是否会增加细菌对多黏菌素E的耐药性。

尼可地尔分子结构中的硝酸基团（-ONO₂）能促进NO释放，有助于血管扩张和疼痛缓解。尼可地尔的抗氧化特性源于其直接清除羟基自由基的能力，从而抑制自由基产生。它调节NO稳态，发挥抗氧化作用，减轻炎症和凋亡反应。它常用于患有缺血性心脏病的老年人。多黏菌素E等抗菌药物通过引起氧化应激导致细菌死亡，用于治疗多重耐药（MDR）细菌感染。然而，尼可地尔的抗氧化特性与抗菌药物作用机制之间的相互作用，特别是在碳青霉烯耐药肠杆菌目感染背景下，仍知之甚少。

因此，本研究旨在评估尼可地尔与多黏菌素E联合使用对肺炎克雷伯菌的活性，并部分阐明尼可地尔影响肺炎克雷伯菌对多黏菌素E耐药性的分子机制。

2 材料与方法

2.1 菌株与试剂

从安徽省细菌耐药监测中心呼吸道样本中分离出30株临床肺炎克雷伯菌菌株。所有菌株均通过MALDI-TOF MS自动化微生物系统鉴定为肺炎克雷伯菌。分离株保存在含50%甘油的Muller-Hinton肉汤（MHB）的冻存管中，于-80°C保存，并在37°C的Muller-Hinton琼脂（MHA）上培养。抗生素、尼可地尔、N-乙基烟酰胺和N-(2-羟乙基)烟酰胺购自Sigma-Aldrich。用于抗生素制备的溶剂和稀释剂遵循最新CLSI指南。从安徽省实验动物中心获取8周龄野生型雌性C57BL/6小鼠。末龄大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫在4°C黑暗环境中保存，并在收到后7天内使用。安徽医科大学机构动物护理与使用委员会批准了所有小鼠实验。

2.2 抗菌药物敏感性试验

采用肉汤微量稀释法评估所有抗生素对肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度（MIC），遵循EUCAST和CLSI指南。多黏菌素E的MIC值定义为抑制可见细菌生长的最低药物浓度。根据CLSI折点解释黏菌素MIC，耐药定义为MIC ≥ 4 mg/L。

2.3 快速杀菌试验

对30株临床肺炎克雷伯菌菌株和一株标准菌株ATCC 43816进行快速杀菌试验。菌株在5 mL MHB肉汤中培养过夜，稀释至0.5麦氏浊度，然后与不同浓度的多黏菌素E、尼可地尔及两者组合一起孵育。在0、2和4小时取样，稀释后涂布于MHA琼脂平板，计数菌落。拮抗活性定义为两种药物联合使用时比各自单独使用减少≥ 2 log₁₀。

2.4 生长曲线测定

选定的菌株在5 mL MHB培养基中过夜培养，稀释至0.5麦氏浊度，然后用不同浓度的多黏菌素E、尼可地尔及其组合处理。将100 μL细菌培养物分装到96孔平板中，在37°C读数器上生长24小时，每60分钟测量600 nm光密度（OD）值。

2.5 活性氧产生

使用荧光探针carboxy-H2DCFDA检测细胞内ROS积累。将GN 191035过夜培养物稀释1:100，用尼可地尔（64 μg/mL）、亚MIC多黏菌素E（32 μg/mL）及其组合处理4小时。样品用探针孵育后，通过流式细胞仪评估荧光强度， indicating ROS production。

2.6 活性氮产生

使用DAF-FM DA检测细胞内RNS积累。处于指数生长期的肺炎克雷伯菌GN 191035与5 μM DAF-FM DA孵育30分钟，清洗后，用尼可地尔、N-乙基烟酰胺、N-(2-羟乙基)烟酰胺（0 μg/mL, 64 μg/mL）处理120分钟。处理后，通过流式细胞仪测量荧光强度， indicating RNS production。

2.7 RNA提取

菌株在5 mL MHB培养基中过夜培养，稀释后与尼可地尔（64 μg/mL）、亚MIC多黏菌素E（32 μg/mL）及其组合孵育4小时。取1 mL菌悬液，使用RNAiso Plus提取总RNA，经氯仿、异丙醇和乙醇处理后，溶解于DEPC-H₂O中，用NanoDrop测量浓度和纯度。

2.8 定量实时PCR分析

使用测得的RNA浓度进行逆转录。反应体系包含500 ng总RNA、2 μL 5× RT PCR Mix和RNase-free DEPC-H₂O，总体积10 μL。反应条件：37°C 15分钟，85°C 5秒，4°C保存。将逆转录生成的cDNA用于实时定量PCR（qPCR）。qPCR反应体系（20 μL）包含10 μL TB Green premix Ex Taq II、0.5 μL正向和反向引物、1 μL合成的cDNA和ddH₂O。在LightCycler 96实时PCR系统上进行定量循环：95°C 30秒，然后90°C 5秒，60°C 30秒，72°C 20秒，重复40个循环。以rrsE6扩增子作为内参，检测sodA、sodC、katE和katG的表达。通过2^-ΔΔCT计算方法确定目的基因的表达水平，以倍数变化值报告。

2.9 小鼠肺部感染模型

基于先前研究，建立肺部感染模型以评估尼可地尔对体内细菌活性的影响。雌性C57BL/6小鼠（每组8只）用戊巴比妥钠麻醉。通过气管使用鼻腔装置向肺部直接接种50 μL早期对数期菌悬液（GN 191035, 1.5×10⁷ CFU/mL）以诱导肺部感染。尼可地尔用无菌盐水制备。接种后4小时，一组小鼠（n=8）接受腹腔注射多黏菌素E（5 mg/kg/天）、尼可地尔（20 mg/kg/天）、两者组合或磷酸盐缓冲盐水（对照）。这些治疗每8小时分两次给药。随后，在给予这些治疗之前（0小时）和之后24小时，处死小鼠收集肺组织样本。右肺用于病理检查，左肺叶研磨。将1000 μL研磨肺叶在磷酸盐缓冲盐水中系列稀释，涂布于营养琼脂平板，37°C过夜培养进行菌落计数，并计算每只小鼠肺中的细菌负荷（log₁₀ CFU/肺）。体内疗效通过计算每肺log₁₀ CFU的变化来确定，比较24小时处理组小鼠与0小时对照组（Δlog₁₀ CFU/肺 = log₁₀ [处理组] CFU/肺 ? log₁₀ [对照组] CFU/肺）。对于组织学分析，肺组织用多聚甲醛固定，切成4-mm切片，脱蜡，并用苏木精和伊红（H&E）染色。病理学评分遵循先前建立的方法。总肺炎症评分通过 summing each parameter的分数来计算，最高可能得分为24。

2.10 大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫感染模型

使用改良的存活试验评估多黏菌素E单独及与肺炎克雷伯菌联合对感染GNB的大蜡螟的疗效。实验研究使用5周龄幼虫。幼虫长度2至2.5厘米，呈乳白色。幼虫在使用前于4°C保存，并在感染前饥饿24小时。主要感染途径是通过最后左前腿或皮肤进行血腔注射。每个实验 trial 使用16只幼虫。感染后，幼虫在高达37°C的温度下维持。将肺炎克雷伯菌（GN 191035）的过夜培养物用无菌NS调整至1×10⁵ CFU/mL。注射标准盐水的小鼠作为对照。每组16只幼虫使用微量注射器向左后肢注射10 μL菌悬液。感染后2小时给予的治疗包括多黏菌素E（0.01 μg, 0.02 μg）、尼可地尔（0.64 μg）、多黏菌素E和尼可地尔组合，或磷酸盐缓冲盐水对照治疗。幼虫在37°C有氧孵育三天，每12小时记录一次大蜡螟存活率。每个实验进行三次重复。如果幼虫对重复物理刺激没有反应，则认为其死亡。

2.11 统计分析

数据是三次独立实验的平均值，误差条表示标准误。使用Student双尾非配对t检验进行图1B、C，图2C，图3C、D的组间比较。此外，采用log-rank（Mantel-Cox）检验比较图3E的组间总生存期。统计学显著性表示如下：表示P < 0.05，表示P < 0.01，表示P < 0.001，表示P < 0.0001。使用Prism 10.0、FlowJo 10.8.1和Illustrator CC 2024创建图表。

3 结果

3.1 多重耐药肺炎克雷伯菌临床分离株

本研究涉及来自安徽省细菌耐药监测中心的30株临床肺炎克雷伯菌菌株。所有菌株均通过自动化MALDI-TOF MS微生物系统鉴定。采用肉汤微量稀释法评估11种抗生素的最低抑菌浓度（MICs）。所有（100%）肺炎克雷伯菌分离株（30/30）被鉴定为碳青霉烯耐药MDR肺炎克雷伯菌菌株，而20%（6/30）的分离株对多黏菌素E耐药。

3.2 尼可地尔对多黏菌素E抗菌活性的影响

本研究探讨了尼可地尔与多黏菌素E之间的相互作用，重点关注尼可地尔对多黏菌素E抗肺炎克雷伯菌疗效的影响。对30株临床分离株和ATCC 43816菌株进行了快速杀菌试验。当尼可地尔与多黏菌素E共同给药时，在51.6%（16/31）的分离株中观察到拮抗相互作用，导致肺炎克雷伯菌生长增加1–3 log₁₀ CFU/mL。相反，在48.4%（15/31）的分离株中检测到相加效应。

值得注意的是，肺炎克雷伯菌GN 191035菌株的效果最为显著。单独施用64 μg/mL尼可地尔不影响细菌生长。然而，128 μg/mL或256 μg/mL（2×MIC和4×MIC）多黏菌素E与64 μg/mL尼可地尔组合显著降低了杀菌活性，导致 comparable increase of 2 to 3 log₁₀ CFU/mL。为了研究尼可地尔对多黏菌素E抗GN 191035细胞疗效的影响，进行了生长曲线测定。该测定涉及施用不同浓度的多黏菌素E（0×、1.5×和2×MIC）与尼可地尔组合。结果表明，单独使用多黏菌素E能有效根除细菌；然而，当与尼可地尔组合时，观察到显著且快速的细菌增殖。这些发现表明，尼可地尔可能降低多黏菌素E对特定细菌菌株的抗菌有效性。

3.3 尼可地尔减轻多黏菌素E诱导的氧化应激

研究表明，多黏菌素E触发革兰阴性菌中羟基自由基的产生，导致细胞死亡。通过使用carboxy-2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（carboxy-H2DCFDA）测量细胞内ROS水平来评估尼可地尔对多黏菌素E诱导的ROS积累的影响。流式细胞术分析显示，多黏菌素E组ROS水平升高，而尼可地尔处理组未显示显著改变。值得注意的是，与单独使用多黏菌素E处理组相比，肺炎克雷伯菌联合治疗组的ROS水平降低。基于此，我们提出尼可地尔对多黏菌素E杀菌机制的拮抗作用主要归因于其抑制多黏菌素E引发的氧化应激反应。

过氧化氢酶和超氧化物歧化酶在调节细胞对氧化应激的反应中起关键作用。我们研究了多黏菌素E（含和不含尼可地尔）对sodA和sodC（超氧化物歧化酶）以及katE和katG（过氧化氢酶）表达的影响。我们在用尼可地尔、多黏菌素E或它们的组合处理4小时后，对GN 191035进行了RT-qPCR测定。研究表明，尼可地尔和多黏菌素E共同给药显著降低了sodA、sodC、katE和katG的表达水平，与单独使用多黏菌素E处理相比。为了证实这些发现，我们使用另一种肺炎克雷伯菌菌株GN 230444进行了qPCR测定。与在191035菌株中的观察结果一致，外源尼可地尔处理后，GN 230444中sodA、sodC、katE和katG的表达水平降低。在尼可地尔存在下观察到的SOD和KAT表达下调表明，尼可地尔减轻了多黏菌素E诱导的ROS水平。

3.4 尼可地尔释放一氧化氮，保护肺炎克雷伯菌免受多黏菌素E的杀伤

研究表明，NO能提供针对过氧化氢（H₂O₂）引起的氧化应激的即时保护。尼可地尔分子结构中含有硝酸基团（–ONO₂），可以向人体释放NO。本研究调查了尼可地尔在细菌系统中释放NO的潜力。使用DAF-FM DA评估了尼可地尔存在下活性氮物种（RNS）的积累。结果显示，尼可地尔处理后细胞内RNS水平显著增加。此外，当将两种缺乏硝酸基团的结构类似物N-乙基烟酰胺和N-(2-羟乙基)烟酰胺引入培养物时，未观察到变化。总的来说，这些发现表明尼可地尔通过其硝酸基团释放NO。

为了确定尼可地尔是否通过释放NO来减轻多黏菌素E对肺炎克雷伯菌的杀菌作用，我们评估了N-乙基烟酰胺、N-(2-羟乙基)烟酰胺和尼可地尔（单独及与多黏菌素E组合）对细菌增殖的影响。这是通过点稀释试验和生长曲线抑制分析实现的。

点稀释试验表明，多黏菌素E与尼可地尔组合显著加速了细菌生长，在4小时时显示增加1 log₁₀ CFU/mL，在6小时时增加3 log₁₀ CFU/mL。相反，当多黏菌素E与两种类似物组合或单独给药时，未检测到显著的细菌生长。在生长曲线抑制分析中，无论是否存在N-乙基烟酰胺和N-(2-羟乙基)烟酰胺，多黏菌素E都表现出有效的杀菌活性。然而，添加尼可地尔显著降低了这种杀菌效果。这一观察表明，两种类似物均不能复制这种效应，提示硝酸基部分对尼可地尔的拮抗作用至关重要。随后，我们使用DAF-FM DA作为检测方法，全面研究了尼可地尔在细菌系统中释放的NO水平的时间变化，并使用快速杀菌试验评估了它们对多黏菌素E疗效的影响。我们的发现表明，在添加多黏菌素E之前与尼可地尔孵育一小时会导致细胞内活性氮物种（RNS）积累增加和细菌清除率降低。相反，当在添加多黏菌素E之前将尼可地尔孵育延长至六小时，结果相反。总的来说，这些发现表明尼可地尔释放NO，从而保护肺炎克雷伯菌免受多黏菌素E的杀伤。

3.5 尼可地尔降低多黏菌素E在体内模型中的抗菌疗效

为了评估尼可地尔对多黏菌素E体内抗菌疗效的影响，研究人员建立了肺炎克雷伯菌诱导的小鼠肺损伤模型和使用大蜡螟幼虫的感染模型。在感染肺炎克雷伯菌GN 191035的小鼠肺模型中，单独多黏菌素E治疗组与对照组相比无统计学显著差异。接受多黏菌素E和尼可地尔联合治疗组的肺细菌负荷显著高于单独多黏菌素E治疗组。此外，对肺病理学进行了评估，并对肺炎克雷伯菌感染后的组织进行了半定量评分。组织病理学分析显示，所有感染小鼠均表现出严重的肺炎，特征为支气管炎、间质性炎症、水肿、内皮炎、胸膜炎和血栓形成。

我们使用大蜡螟感染模型进一步评估了我们的组合方法在体内的效果，并对生存曲线进行了统计分析。在感染肺炎克雷伯菌GN 191035的大蜡螟模型中，单独多黏菌素E治疗在接种后72小时存活率为68.65%。相比之下，用尼可地尔和多黏菌素E组合治疗的大蜡螟标本中，由细菌感染导致的死亡率显著更高。

4 讨论

多重耐药细菌感染的兴起对公共卫生构成重大威胁，需要研究新的治疗方法。使用NO供体作为一种有前景的方法来增强抗生素疗效已引起关注。然而，我们的发现揭示了这一策略一个先前未被充分认识的方面，即NO供体与某些抗生素之间潜在的拮抗相互作用。本研究考察了临床上重要的病原体——碳青霉烯耐药多重耐药肺炎克雷伯菌及其对多黏菌素E的耐药性，多黏菌素E是治疗多重耐药革兰阴性菌感染的关键最后手段。对多黏菌素E耐药性的日益普遍凸显了理解可能进一步损害其疗效的因素的紧迫性。我们的研究探讨了尼可地尔（一种常用的具有NO释放特性的血管扩张剂）与多黏菌素E之间的相互作用，揭示了可能影响临床治疗策略的潜在拮抗效应。

先前的研究表明，NO可以提高抗生素有效性，并且将NO供体与抗生素结合可以消除耐药菌株。然而，我们的发现显示，尼可地尔在51.6%的测试肺炎克雷伯菌临床分离株中与多黏菌素E表现出拮抗相互作用，导致细菌增殖显著增加。多黏菌素E对肺炎克雷伯菌的抗菌疗效可以通过硝酸镓诱导ROS积累而增强。先前的研究表明，NO可以通过减轻氧化应激来提高细菌的抗生素耐药性。我们的研究通过显示尼可地尔显著降低多黏菌素E诱导的ROS水平（通过流式细胞术分析和抗氧化酶基因（包括sodA、sodC、katE和katG）的下调证实了这一点。因此，假设NO可能通过减轻多黏菌素E引起的氧化应激来保护细菌。

为了进一步验证我们的发现，我们采用了小鼠肺损伤模型和大蜡螟感染模型。在小鼠模型中，与单独使用多黏菌素E相比，尼可地尔和多黏菌素E的组合显著增加了肺细菌负荷，尽管多黏菌素E治疗组与对照组之间缺乏显著差异。组织病理学分析显示所有感染小鼠均患有严重的肺炎，联合治疗的小鼠病理变化更明显。同样，在大蜡螟模型中，尼可地尔和多黏菌素E的组合比单独使用多黏菌素E导致更高的死亡率。这些体内结果证实了我们的体外观察，确认了尼可地尔和多黏菌素E之间的拮抗相互作用。

这表明尼可地尔对多黏菌素E的拮抗作用主要归因于其减轻氧化应激的能力。类似的机制在其他抗氧化剂中也观察到，如多索茶碱和姜黄素。该研究强调了联合使用尼可地尔和多黏菌素E的潜在风险，尤其是在治疗由多重耐药肺炎克雷伯菌引起的感染时。鉴于尼可地尔广泛用于缺血性心脏病，这些发现对于优化抗菌治疗和最小化药物相互作用具有重要的临床意义。未来的研究应检查尼可地尔与其他抗菌剂之间的相互作用，并研究调节NO释放或增加氧化应激以增强多黏菌素E疗效的方法。还需要进一步的研究在不同的临床分离株和感染模型中验证这些发现。