整合生物信息学与实验验证揭示新型VRK评分作为肝细胞癌预后与治疗生物标志物

　　本研究通过整合多组学数据与实验验证，首次构建基于VRK家族基因的预后评分模型（VRK score），揭示其作为肝细胞癌（HCC）独立预后因子和治疗反应预测标志物的潜力。研究发现高VRK评分与不良预后、免疫检查点抑制剂耐药及化疗药物敏感性降低显著相关，并通过体内外实验证实VRK2通过PI3K/AKT/mTOR通路促进HCC进展，为HCC精准治疗提供新靶点。

　　

1 引言

肝细胞癌（HCC）是全球发病率第六、死亡率第三的恶性肿瘤，占原发性肝癌的80%。尽管治疗手段不断进步，其5年生存率仍不理想，部分归因于缺乏有效的预后和治疗生物标志物。近年来基于生物信息学构建的预后特征和生物标志物筛选已成为预测HCC患者结局和药物疗效的有效手段。然而现有模型存在局限性，尤其是算法产生的风险系数值因样本异质性在不同队列中存在差异，导致主观选择偏差。

疫苗相关激酶（VRK）家族基因包括VRK1、VRK2和VRK3，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性。该家族基因在肿瘤细胞周期、DNA损伤应答和转移中起关键作用。既往研究表明VRK1敲低可阻滞HCC细胞周期并抑制增殖，VRK2在索拉非尼耐药HCC细胞中富集且其敲低可克服耐药性。但针对VRK家族基因在HCC患者结局和治疗效果中的系统性研究仍缺乏。本研究旨在通过生物信息学方法构建基于VRK家族基因的新型预后特征，以评估HCC预后和治疗疗效。

2 材料与方法

2.1 数据收集与处理

从TCGA、ICGC和GEO数据库获取HCC患者mRNA表达谱和临床信息。剔除临床信息不完整的样本后，最终形成TCGA队列（365肿瘤/50正常）、ICGC队列（203肿瘤/177正常）和GEO队列（239肿瘤/239正常）。

2.2 VRK评分构建与独立预后分析

采用单样本基因集富集分析（ssGSEA）算法计算每个样本的VRK评分。使用"survival"包选择最佳截断值，通过SPSS进行单变量和多变量Cox分析，采用"rms"包绘制列线图和校准曲线。

2.3 免疫与肿瘤微环境分析

基于TIMER2.0数据库的6种算法（XCELL、TIMER、MCPCOUNTER、QUANTISEQ、EPIC和CIBERSORT）进行免疫细胞浸润分析。使用ssGSEA算法计算免疫细胞和功能评分，通过TIDE数据库预测免疫检查点阻断反应。

2.4 基因突变分析与药物敏感性预测

采用"maftools"包进行基因突变和肿瘤突变负荷（TMB）分析，使用"pRRophetic"包预测药物敏感性。

2.5 细胞实验与动物模型

培养MHCC97H细胞，通过siRNA和shRNA敲低VRK2表达。采用CCK-8、集落形成、伤口愈合和Transwell实验评估细胞增殖和转移能力。建立BALB/c裸鼠异种移植模型，通过免疫组化和Western blotting验证实验结果。

3 结果

3.1 VRK家族基因表达水平

在22种癌症中，VRK家族基因在乳腺、胆管、食管、肺和结肠癌中高表达，在肾癌和甲状腺癌中低表达。三个独立HCC队列均显示VRK家族基因在肿瘤组织中高表达。亚组分析显示VRK2表达与TNM分期密切相关，VRK家族基因表达与TP53突变显著相关而非CTNNB1。HPA数据库免疫组化结果证实VRK家族蛋白在肿瘤组织中表达升高。相关性分析显示VRK1与VRK2表达呈显著正相关。

3.2 VRK评分建立与独立预后分析

预后分析显示高VRK1或VRK2表达患者总生存期较差，而VRK3表达在不同队列中预后结果不一致。因此选择VRK1和VRK2通过ssGSEA算法构建VRK评分。高VRK评分患者在所有队列中均显示较差的总生存期。Cox分析表明VRK评分是HCC的独立预后风险因子，不劣于TNM分期。列线图可视化评估HCC预后，校准曲线验证了列线图的准确性。

3.3 肿瘤微环境与免疫检查点阻断反应分析

免疫浸润热图显示VRK评分与B细胞、T细胞、巨噬细胞和NK细胞等多种免疫细胞显著相关。高VRK评分组特征为巨噬细胞、滤泡辅助T细胞（Tfh）和调节性T细胞（Treg）水平升高，而肥大细胞水平和干扰素（IFN）应答降低。TIDE分析预测低VRK评分组对免疫检查点阻断（如抗PD-1治疗）的反应率更高。GSEA分析显示高VRK评分组中E2F靶点、G2M检查点、DNA修复、有丝分裂纺锤体、mTORC1信号和MYC靶点通路富集。

3.4 突变、TMB与药物敏感性分析

基因突变频率瀑布图显示TP53和CTNNB1在高、低VRK评分组中均频繁突变。肿瘤突变负荷（TMB）分析表明高TMB患者总生存期较差，高TMB结合高VRK评分患者预后最差。药物敏感性分析显示低VRK评分患者对索拉非尼、吉西他滨、紫杉醇和顺铂更敏感，这些结果在多个队列中得到验证。

3.5 VRK2敲低抑制HCC细胞增殖和转移

Western blot验证siRNA成功敲低VRK2蛋白表达。CCK-8和集落形成实验表明VRK2敲低抑制MHCC97H和HCCLM3细胞增殖能力。伤口愈合和Transwell实验显示VRK2敲低抑制细胞迁移和侵袭能力。VRK2敲低增强HCC细胞对顺铂的敏感性。GSEA分析发现PI3K/AKT/mTOR通路在高VRK2表达组中富集，Western blot证实VRK2敲低降低AKT1和RPS6磷酸化水平。

体内实验显示VRK2敲低抑制肿瘤生长，伴随肿瘤重量和体积减少。H&E染色验证移植瘤为肿瘤组织，Ki-67染色表明VRK2敲低降低肿瘤增殖能力。

4 结论

本研究通过ssGSEA算法构建了独立于训练集特定系数值的新型VRK评分模型，克服了既往模型的局限性。VRK评分能精确预测HCC患者预后和治疗反应，在多个独立队列中验证其作为独立预后因子的稳健性。研究发现高VRK评分与不良预后、免疫检查点抑制剂耐药及化疗药物敏感性降低显著相关。实验验证证实VRK2敲低通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路抑制HCC生长和转移。该研究为HCC精准治疗提供了新的生物标志物和治疗靶点，具有重要的临床转化价值。

研究局限性包括缺乏前瞻性研究验证以及未深入探讨VRK家族基因的分子机制。未来需要进一步开展多中心前瞻性研究并深入探索VRK家族基因在HCC中的具体作用机制。