基于新型物种特异性基因组靶标的多重环介导等温扩增技术快速鉴定主要分枝杆菌物种

　　本研究开发了一种靶向新型物种特异性基因组标记的多重环介导等温扩增（LAMP）检测技术，可同时检测结核分枝杆菌复合群（MTBC）和六种临床重要非结核分枝杆菌（NTM）物种。该技术具有高灵敏度（MTBC检测限76.013 CFU/mL）和特异性（无交叉反应），临床验证显示对痰样本的检测灵敏度达90.32%，特异性97.55%。其冻干试剂稳定、操作简便且成本低廉，为资源有限地区提供了可靠的结核病和NTM感染诊断解决方案。

　　

背景

分枝杆菌属包含结核分枝杆菌复合群（MTBC）和非结核分枝杆菌（NTM）等多种物种，对全球公共卫生构成重大威胁。世界卫生组织2024年报告显示，2023年全球结核病新发病例达1080万，死亡病例125万。与此同时，NTM感染在免疫缺陷人群中日益凸显，其临床表现与结核病相似但治疗方案截然不同，因此准确鉴定分枝杆菌物种对临床诊疗和公共卫生防控具有关键意义。传统鉴定方法难以区分密切相关的NTM物种，而现有分子技术虽在速度和准确性上有提升，却受限于基础设施要求高、操作复杂且成本昂贵，在结核病和NTM高负担的资源有限地区应用受限。

材料与方法

研究团队通过系统生物信息学分析筛选新型物种特异性基因组靶标。从NCBI GenBank数据库获取代表性菌株的完整基因组序列，每物种至少包含5株，包括MTBC及主要NTM物种如鸟分枝杆菌（M. avium）、胞内分枝杆菌（M. intracellulare）、堪萨斯分枝杆菌（M. kansasii）、脓肿分枝杆菌（M. abscessus）、戈登分枝杆菌（M. gordonae）和偶然分枝杆菌（M. fortuitum）。采用渐进Mauve算法和BLAST进行基因组比对，筛选保守且物种特异的区域，要求靶标存在于目标物种所有测序菌株中，在非目标物种中缺失或显著差异，且具有低种内变异、合适长度（200~500 bp）和GC含量。最终选定靶标包括MTBC的IS6110、鸟分枝杆菌的gyrB、胞内分枝杆菌的假设蛋白XDL66245.1、堪萨斯分枝杆菌的假设蛋白B1T47_13295、脓肿分枝杆菌的erm(41)、戈登分枝杆菌的ITS和偶然分枝杆菌的dnaA。所有分枝杆菌物种共有的16S rRNA基因作为内参扩增控制。

使用PrimerExplorer V5软件设计物种特异性LAMP引物，包括前向内引物（FIP）、后向内引物（BIP）、外引物（F3和B3）及环引物（LF和LB）。采用冻干技术将引物、酶和dNTPs预固定在反应管底部，提高试剂稳定性和现场适用性。反应在25μL体系中进行，包含1×等温扩增缓冲液、6 mM MgSO₄、1.4 mM dNTP、各引物（F3/B3 0.2 μM, FIP/BIP 1.6 μM, LF/LB 0.8 μM）、8U Bst II Pro DNA聚合酶大片段、0.5μL SYTO-9和5μL模板DNA，在SLAN-96S实时PCR系统上63°C反应30秒，随后40循环63°C 1分钟。

分析灵敏度通过系列稀释菌液加标阴性痰样本评估，浓度范围10-10⁵ CFU/mL，每个稀释度重复20次，采用概率单位回归模型确定95%检出概率的检测限（LOD）。特异性评估使用28种分枝杆菌菌株和8种非分枝杆菌呼吸道病原体的基因组DNA。临床验证包含52株培养分离株和349份痰样本，以GeneXpert MTB/RIF和商业化PCR-反向点杂交试剂盒为参照方法。

结果

分析灵敏度显示，该检测对MTBC的LOD为76.013 CFU/mL（95% CI: 60.329-113.924），对NTM总体为366.440 CFU/mL（95% CI: 305.954-506.989）。各NTM物种LOD分别为：鸟分枝杆菌403.564 CFU/mL（95% CI: 325.858-564.242）、胞内分枝杆菌404.178 CFU/mL（95% CI: 295.311-846.424）、堪萨斯分枝杆菌166.602 CFU/mL（95% CI: 128.031-284.379）、脓肿分枝杆菌337.389 CFU/mL（95% CI: 240.078-811.646）、戈登分枝杆菌391.61 CFU/mL（95% CI: 268.018-1116.418）、偶然分枝杆菌690.629 CFU/mL（95% CI: 567.488-928.856）。特异性验证显示无交叉反应，所有28株分枝杆菌均被正确鉴定。

在52株临床分离株中，所有NTM菌株（52/52）均成功检出。物种水平上，正确鉴定胞内分枝杆菌（18/18）、鸟分枝杆菌（5/5）、堪萨斯分枝杆菌（10/10）、偶然分枝杆菌（4/4）和戈登分枝杆菌（2/2）。13株脓肿分枝杆菌中检出12株，未检出株经测序证实为脓肿分枝杆菌复合群中的马赛分枝杆菌（M. massiliense）。

在349份痰样本中，GeneXpert确认186份MTBC阳性。该检测检出168份，灵敏度90.32%（95% CI: 85.14%-94.16%）。163份参照阴性样本中正确鉴定159份，特异性97.55%（95% CI: 93.84%-99.33%）。总体符合率93.70%（327/349；95% CI: 90.61%-96.01%），Kappa系数0.8740（95% CI: 0.8233–0.9248）表明高度一致性。按细菌载量分层分析显示，检测率随载量降低而下降：高载量100%、中等96.3%、低91.3%、极低72.0%，符合核酸扩增技术在低菌量样本中的性能特征。

讨论

本研究通过比较基因组筛选开发了基于新型物种特异性遗传靶标的多重LAMP检测技术，解决了现有方法如ITS、16S rRNA或hsp65靶向检测对密切相关的物种或亚种区分能力不足的问题。新靶标如XDL66245.1（胞内分枝杆菌）、B1T47_13295（堪萨斯分枝杆菌）和dnaA（脓肿分枝杆菌）表现出高种间特异性，与既往依赖泛分枝杆菌标记的LAMP检测相比，实现了更精细的物种水平分辨。

该检测对MTBC的灵敏度超越许多商业化NAAT，如GeneXpert MTB/RIF（113–131 CFU/mL）和loopamp MTBC检测试剂盒（约100 CFU/mL）。对NTM物种的检测灵敏度在临床相关范围内，尤其堪萨斯分枝杆菌的优异检测性能具有重要临床意义，因此该病原体常因症状重叠被误诊为结核病。在物种水平测试中，所有目标菌株均被准确鉴定，唯一未检出的脓肿分枝杆菌分离株实为马赛分枝杆菌，因其缺乏靶向erm(41)区域，这凸显了当前检测方法的诊断差距和亚种水平区分的必要性。

临床痰样本检测性能稳健，与GeneXpert相比表现出高灵敏度、特异性和一致性。按细菌载量分层显示检测率随菌量减少而降低，这与核酸扩增技术的固有局限性一致，但不显著削弱其在常规诊断中的实用性。该平台独特优势在于能同时检测MTBC和主要NTM物种，等温扩增特性无需热循环仪，适合资源有限或基层机构使用。高扩增效率和抑制物耐受性增强了对粗提临床样本的适用性。估计检测成本约6-8美元/测试，远低于GeneXpert（约65美元），操作仅需基本移液技能和便携式荧光读数仪，非专业人员经1-2天培训即可掌握，支持在基层实验室和资源有限地区实施。

研究存在一定局限性：NTM物种选择基于2019-2021年本机构临床分离株分布，未覆盖其他临床重要或新兴NTM物种（如M. simiae、M. xenopi、M. massiliense），因菌株可获得性有限。 assay开发过程中虽为额外物种（如M. chelonae、M. simiae、M. marinum等）设计了引物组，但缺乏代表性临床分离株未能验证。未来将纳入这些靶标以扩展检测范围。鉴于NTM流行率存在显著地域差异，包含当地优势物种的区域适应性面板可进一步提升检测实用价值，增强其在流行病学监测和临床管理中的相关性。脓肿分枝杆菌假阴性案例表明需要扩展亚种水平靶标，尤其涉及耐药机制时。另一局限是缺乏全基因组测序验证引物特异性和靶标稳定性。最后，尽管冻干技术在受控实验室条件下改善试剂稳定性，但可变现场环境下的长期性能和粗提样本抑制物耐受性数据尚待建立。

未来改进可进一步提升临床实用性：纳入耐药相关位点（如rpoB、katG、rrl）可实现物种鉴定和耐药谱分析同步进行。多数耐药突变属SNP基础，染料法LAMP难以可靠区分野生型和突变型，需探针法熔解曲线分析，但LAMP中探针设计限于环引物区域，灵活性受限。最后，将检测与微流控芯片技术结合可为现场部署提供可行策略，通过将样本前处理、核酸提取和扩增整合至单一平台，实现真正"样本进-结果出"工作流程，减少人工操作，降低污染风险，促进在基层或资源有限地区的使用。

结论

本研究介绍了一种新型多重LAMP检测技术，具有良好的分析和临床性能。通过纳入新物种特异性靶标，该方法提高分枝杆菌鉴别的分辨率和可靠性，解决当前诊断平台的关键局限。其快速、准确和操作简单的特点非常适合常规使用和床旁部署，尤其在结核病高负担或资源有限地区。凭借稳健性、简易性和现场适用性，该检测有强大潜力作为基层结核病规划的诊断工具，并加强资源有限地区的NTM监测工作。