多物种生物膜形成关键蛋白互作改变：JG-1与M4化合物的抗生物膜机制研究

　　本综述系统阐述了小分子化合物JG-1与M4通过调控OmpA、OmpC、TrxA等生物膜形成关键蛋白的互作网络，在多物种（包括沙门氏菌、ESKAPE病原体）中发挥抗生物膜作用的全新机制。研究运用RNAseq、热蛋白质组分析（TPP）、定点突变等技术，揭示化合物通过诱导转录重编程（如下调鞭毛/菌毛相关基因）和靶向CodY等调控蛋白，有效驱动生物膜分散或细菌死亡，为治疗慢性感染提供了创新策略。

　　

引言

细菌生物膜是慢性感染治疗中的主要挑战，其通过胞外基质限制抗生素渗透并促进耐药性传播。据估计，65-80%的人类感染与生物膜相关，每年仅在美国就导致55万人死亡。尽管抗生素已被广泛应用，耐药菌感染仍在2019年造成127万人死亡，凸显开发新型抗生物膜药物的紧迫性。革兰阴性菌如沙门氏菌（Salmonella）可在胆囊结石上形成生物膜，导致慢性带菌状态；而ESKAPE病原体（包括肠杆菌属、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和屎肠球菌）则是医疗器械相关感染的主要元凶。针对这一需求，研究者前期发现了两种小分子化合物JG-1与M4，它们在体外可有效抑制和分散鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）及ESKAPE病原体的生物膜，且M4对金黄色葡萄球菌和屎肠球菌还具有杀菌活性。然而，其作用机制尚未明确。

材料与方法

研究选用鼠伤寒沙门尔菌14028、金黄色葡萄球菌USA300和阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）ATCC 13047作为模式菌株，利用BEI资源库获取单基因缺失突变体。生物膜在96孔板中培养24小时后，用含JG-1或M4（浓度2.5-320 μM）的培养基处理，通过结晶紫染色评估生物膜质量变化。为探究机制，研究整合了多种技术：

1. 1.

   RNAseq分析：用10 μM（沙门氏菌）或80 μM（阴沟肠杆菌）化合物处理生物膜2-5小时后提取RNA，通过Illumina平台测序，使用DESeq2进行差异表达分析和ShinyGo通路富集；

2. 2.

   热蛋白质组分析（TPP）：化合物处理的菌体或蛋白在25-90°C梯度加热后，通过LC-MS/MS检测蛋白热稳定性变化，筛选与化合物互作的潜在靶点；

3. 3.

   Pull-down assay：将JG-1和M4生物素化后与细菌裂解液孵育，通过NeutrAvidin树脂捕获互作蛋白，经SDS-PAGE和质谱鉴定；

4. 4.

   表型验证：包括HeLa细胞侵袭实验、硫磺吲哚动力（SIM）培养基运动性检测以及突变体抗性筛查（测定IC₅₀/EC₅₀变化）。

结果

化合物活性依赖细菌代谢能力

通过NaN₃诱导细菌代谢停滞发现，用6% NaN₃预处理2小时可完全抑制细菌代谢（RLU检测），此时JG-1或M4处理无法引起生物膜分散；而移除NaN₃后化合物可恢复分散活性，表明JG-1/M4需代谢活跃的细菌才能发挥功能，而非直接破坏基质结构。

化合物处理引发转录重编程

RNAseq显示，JG-1和M4处理诱导了大量基因差异表达（沙门氏菌中数百个基因）。通路分析发现：

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  沙门氏菌+JG-1：下调趋化性、鞭毛组装和菌毛相关通路，上调抗菌/噬菌体响应；

• •

  沙门氏菌+M4：下调呼吸链和氨基酸代谢基因，上调运动性和胞外聚合物（EPS）合成；

• •

  阴沟肠杆菌+JG-1：下调金属离子转运和转录过程，上调宿主应激逃逸相关通路；

• •

  阴沟肠杆菌+M4：下调群体感应（quorum sensing）和膜转运，上调核糖体生成和蛋白运输；

• •

  金黄色葡萄球菌+M4（杀菌浓度）：上调细胞溶解和金属离子转运通路，提示可能触发毒素介导的“误伤”效应。

JG-1/M4调控侵袭与运动表型

基于转录结果，表型实验验证：

• •

  侵袭实验：JG-1处理显著降低沙门氏菌对HeLa细胞的侵袭（与DMSO对照比），而M4无影响；

• •

  运动性实验：M4处理使沙门氏菌野生型和Δtsr突变体运动直径减少至非运动ΔcheY突变体水平（SIM培养基），但JG-1不影响运动性。

  结果表明JG-1抑制侵袭但不影响运动，M4抑制运动但保留侵袭能力，提示二者机制差异。

热蛋白质组揭示潜在蛋白互作网络

TPP发现JG-1/M4处理增加多种蛋白的热稳定性（沙门氏菌和阴沟肠杆菌中>2500个蛋白受影响）。STRING网络预测显示：

• •

  JG-1处理：核糖体蛋白、外膜蛋白（OMPs如OmpA/OmpC）和翻译因子形成物理互作簇；

• •

  M4处理：核糖体结构蛋白、OMPs和膜结合脱氢酶关联增强。

  这些互作网络表明化合物可能通过稳定蛋白复合物间接影响功能，而非直接结合单一靶点。

Pull-down鉴定直接结合蛋白

生物素化化合物Pull-down联合质谱鉴定出种属特异性结合蛋白：

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  沙门氏菌：JG-1结合OmpA、OmpC、GapA等15种独特蛋白；M4结合AtpA等10种蛋白；

• •

  阴沟肠杆菌：JG-1结合10种独特蛋白；M4结合31种蛋白（包括AtpA同源物）；

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  金黄色葡萄球菌+M4：结合44种蛋白，包括CodY、HchA、AhpC等应激调节因子。

  值得注意的是，OmpA和OmpC在沙门氏菌中被JG-1和M4共同捕获，提示可能为多重靶点。

基因缺失突变体揭示功能靶点

筛查160个沙门氏菌和21个金黄色葡萄球菌突变体发现：

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  沙门氏菌：21个突变体对JG-1抗性增强（EC₅₀升高），53个对M4抗性增强，包括ΔompC（JG-1抗性）、ΔlepA（JG-1/M4双抗性）、ΔyegE（M4抗性）；

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  体内验证：ΔompC突变体在小鼠胆囊慢性感染模型中仍可定植，且JG-1+环丙沙星联合治疗有效，表明OmpC非体内必需靶点；

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  金黄色葡萄球菌：ΔcodY和ΔhchA突变体对M4杀菌和抗生物膜活性均抗性，且ΔcodY基线生物膜形成缺陷。CodY作为全局转录调节因子，其失活可能介导M4的抑菌表型。

讨论

本研究通过多组学整合策略，揭示JG-1和M4通过多靶点互作网络发挥抗生物膜作用：

1. 1.

   物种保守性：化合物在沙门氏菌、阴沟肠杆菌和金黄色葡萄球菌中均有效，但机制存在差异；

2. 2.

   转录重编程：JG-1倾向于抑制粘附相关通路（如鞭毛/菌毛），而M4影响代谢和应激响应；

3. 3.

   蛋白互作：TPP和Pull-down提示化合物可能通过稳定核糖体复合物或OMPs间接影响生物膜稳定性；

4. 4.

   关键靶点：沙门氏菌中OmpC、LepA等蛋白缺失导致化合物抗性，但体内实验提示冗余机制存在；金黄色葡萄球菌中CodY和HchA被确定为M4功能的关键介质——CodY失活抑制生物膜形成并触发毒素表达，HchA缺失则削弱应激解毒能力导致细胞死亡。

   这些发现不仅阐明JG-1/M4的分子机制，也为针对慢性生物膜感染的多靶点药物设计提供了新方向。