靶向二羟基酸脱水酶（DHAD）的新型苯并恶嗪酮衍生物的从头设计与合成：一种新型除草剂先导化合物的发现与机制研究

　　本综述系统阐述了靶向支链氨基酸（BCAA）合成通路关键酶——二羟基酸脱水酶（DHAD）的新型苯并恶嗪酮类除草剂的设计、合成与机制研究。研究通过结构导向药物设计（SBDD）策略，基于DHAD与铁硫簇（[2Fe–2S]）及镁离子的配位作用机制，成功开发出高活性化合物4bb（Kd=83.18?μM），其在体外显著抑制拟南芥种子萌发（50?μg/mL），且活性可通过补充BCAA逆转。温室试验表明4bb对阔叶杂草（如旱莲草Eclipta prostrata和反枝苋Amaranthus retroflexus）抑制率超75%，并具备良好的作物安全性（水稻/小麦）及低细胞毒性（人源细胞系LO2/HaCaT/293T），为新型绿色除草剂的开发提供了重要先导结构与靶点验证。

　　

结构导向分子设计策略

结构导向药物设计（SBDD）是新型农药研发的高效手段。二羟基酸脱水酶（DHAD）作为支链氨基酸（BCAA）合成通路中的第三关键酶，其晶体结构已从多种生物中解析获得。活性口袋中的关键氨基酸（如Tyr215、Phe181）和金属辅因子（铁硫簇、镁离子）高度保守。研究表明，底物与铁硫簇的配位作用是催化核心步骤，而抑制剂与这些金属簇的相互作用是设计的关键。近期，Zhou课题组报道了拟南芥DHAD（AtDHAD）与aspterric acid（AA）的共晶结构（PDB ID 9JPI），显示AA不仅与铁硫簇形成配位作用，还与镁离子协同结合，同时疏水口袋中的芳香氨基酸残基（Tyr215、Phe181间距约8.49??）为引入芳香片段提供了结构基础。

苯并恶嗪酮骨架因其在医药和农药领域的广谱生物活性（如抗病、抗虫、抗炎）而被选为核心分子支架。借鉴aspterric acid的结构特征，研究者在分子中引入羰基片段，以通过氧原子与金属离子形成配位作用。分子对接结果显示，先导结构不仅能维持与金属离子的配位，还可与Phe181形成π-π堆叠作用。基于此模型，研究团队在苯并恶嗪酮环的R¹和R²位引入疏水基团，设计并合成了衍生物4aa–4bb。

化合物4aa?4bb的合成

目标化合物通过三步反应合成：首先以K₂CO₃催化亲核取代反应制备中间体2aa–2ad；随后在Fe/CH₃COOH体系中将硝基还原为氨基，并经分子内亲核消除反应构建苯并恶嗪酮骨架（3aa?3ad）；最后在苯并恶嗪酮环的2位或4位引入不同取代基，得到外消旋的目标化合物4aa–4bb，总收率均超过60%。所有结构经¹H NMR、¹³C NMR和ESI-HRMS表征，其中化合物4au的晶体结构通过X射线衍射解析（CCDC No. 2279776）。

种子萌发抑制活性与构效关系

衍生物对野生型拟南芥种子萌发的抑制活性评估显示，多数化合物在50?μg/mL浓度下具有显著抑制作用。其中化合物4ae和4bb能完全抑制种子萌发，表型症状与阳性对照药剂penoxsulam类似。值得注意的是，化合物对根长的抑制普遍强于茎长，且抑制效应随浓度降低而减弱。

构效关系（SAR）分析表明：R²位为烯丙基（4ae）时活性最优（抑制率>90%），延长烷基链（如4ac, R²=n-丙基）或引入大位阻基团（如4af, R²=3-甲基丁-2-烯-1-基）会降低活性；含芳香取代基的衍生物（4ag–4ax）活性普遍低于烷基取代化合物。分子对接结果显示，烯丙基衍生物4ae的羰基与铁硫簇配位，另一羰基与Thr216形成氢键，而苄基取代（如4ag）会破坏与金属簇的相互作用（距离>5.0??），且苯并恶嗪酮环与Phe181的π-π堆叠作用丢失，结合评分（Total Score）从6.699（4ae）降至6.052（4ag）。R¹位取代基中，甲基或氢原子最适宜（如4ay、4ba）。基于上述分析，研究者进一步合成R¹=H、R²

化合物4bb的作用机制

为验证4bb通过抑制BCAA通路发挥效应，研究者进行了氨基酸补充实验：在含50?μg/mL 4bb或4ae的培养基中添加25?μg/mL BCAA后，拟南芥生长完全恢复，与penoxsulam处理组趋势一致。qRT-PCR分析显示，4bb处理72小时后，DHAD基因表达显著上调（约9倍），KARI表达增加近4倍，而AHAS几乎无变化，表明化合物作用于BCAA合成通路下游。

分子对接比较4bb与AHAS、KARI、DHAD的结合稳定性，显示4bb与KARI结合较差（Total Score=-1.28），而与AHAS（6.96）和DHAD（8.27）结合良好。体外亲和力测试（MST）证实4bb与AtDHAD的结合解离常数（K_d=83.18?μM）优于与ScAHAS（K_d=132.70?μM）。DARTS实验表明，4bb能维持纯化AtDHAD的稳定性，减少Pronase E的降解；Western blot分析进一步验证4bb在体内与NbDHAD特异性结合。

作物选择性

4bb在低浓度（50?μg/mL）下对小麦种子萌发根长抑制率为50%，但对芽生长无影响；水稻在后 emergence处理中即使高剂量仍保持较高安全性。序列比对显示，水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestivum）与杂草（Setaria viridis）的DHAD蛋白相似性超92%，且催化活性位点（Cys、Asp、Asn、Glu、Tyr、Phe、Ser）完全保守，表明化合物选择性并非源于靶点物种差异，而是可能由代谢或转运过程介导。

除草活性

温室盆栽试验中，化合物在150?g?ai/ha剂量下对阔叶杂草（E. prostrata、A. retroflexus）的抑制效果优于禾本科杂草（E. crusgalli、S. viridis）。4bb对E. prostrata和A. retroflexus的鲜重抑制率超75%，对S. viridis的防效接近阳性对照。电子 withdrawing基团（如氟、氰基）取代的苄基衍生物活性优于电子 donating基团（如甲氧基）。

细胞与微生物毒性评估

CCK-8法检测显示，化合物4ae、4ag、4bb和penoxsulam在100?μM浓度下对正常人源细胞系（LO2、HaCaT、293T）均无显著毒性（抑制率<3%），而阳性对照紫杉醇（12.5?μM）抑制率超90%。此外，4bb在100?μM浓度下对大肠杆菌BL21(DE3)增殖无抑制（OD₆₀₀>0.9），对植物病原真菌（如Rhizoctonia solani、Fusarium graminearum）的抑制活性随浓度降低而减弱（50?μg/mL时抑制率<25%），对植物病原细菌（Xanthomonas oryzae）无抑制活性（EC₅₀>128?μg/mL）。这些结果表明4bb具有良好的环境安全性和物种选择性。

讨论

BCAA合成通路仅存在于植物和微生物中，因此DHAD抑制剂具有天然的物种选择性。本研究基于DHAD的配位与疏水相互作用机制，设计出苯并恶嗪酮类衍生物，其中4bb展现出高除草活性、作物安全性与低毒性。机制研究证实其通过抑制DHAD阻断BCAA合成，且物种选择性源于靶点构象差异而非序列保守性。该工作不仅验证了DHAD作为除草剂靶点的可行性，也为后续优化提供了领先分子骨架与设计策略。