揭示外源性蛋白质与细胞外囊泡关联中货物分布的异质性：从单颗粒水平解析载货效率与异质性的新视角

　　本文系统评估了多种外源性方法（如电穿孔、超声处理、冻融循环等）将模型货物蛋白GFP与细胞外囊泡（EVs）结合的效率与异质性。研究结合整体水平（SEC-MALS-FLD、流式细胞术）和单颗粒水平（dSTORM-DBSCAN超分辨显微技术）的分析手段，发现电穿孔虽为最有效方法，但总体载货效率仍较低（约0.004%），且EVs中GFP分布呈现显著异质性，遵循指数衰减规律。该研究强调了EVs作为药物递送载体时载货分布不均一性的关键问题，为优化EV载药策略与质量控制提供了重要见解。

　　

引言

细胞外囊泡（EVs）是由所有细胞分泌到胞外空间的纳米颗粒，作为介导多种生物过程的信息载体，能够传递遗传信息、信号分子、蛋白质和脂质至受体细胞，从而诱导表型改变和功能响应。EVs跨越生物膜传递信号的能力使其成为开发药物递送载体的热点，尤其是用于递送蛋白质等生物大分子，以改善靶向递送并开辟蛋白质胞内递送的新途径。然而，将生物大分子与EVs稳定、均一地结合仍面临挑战。载货方法分为内源性和外源性两种策略，外源性方法如电穿孔、超声处理和冻融循环等通过在EV膜上产生瞬时孔隙使货物蛋白与EVs结合。尽管这些方法已取得一定成功，但每种方法都存在局限性，如内源性载货可能导致EVs群体高度异质，而外源性载货则因EVs体积分数极低（约0.001%），载货效率普遍低下，且需有效分离EVs与游离货物。此外，载货分布在EV群体中的异质性会显著影响其靶向效率、药代动力学和免疫清除，进而影响治疗效力和可重复性。因此，量化EVs载货分布的异质性对优化载货策略和推动临床转化至关重要。

结果与讨论

2.1 外源性载货方法的整体水平生物物理评估

研究首先通过两种分析技术在整体水平评估了GFP与EVs的结合效率。尺寸排阻色谱联用荧光检测和多角度光散射技术（SEC-MALS-FLD）能够测量EVs的浓度、大小及与EVs共洗脱或游离的荧光标记组分，从而评估载货效率和处理过程中的EVs损失。另一种方法采用基于珠子的流式细胞术（FC），通过抗CD81抗体包被的珠子捕获EVs并监测GFP荧光信号。SEC-MALS-FLD分析显示，电穿孔在总载货量方面最为有效，从溶液中的400,000 fmol GFP中加载了15 fmol，载货效率约为0.004%；而超声处理、冻融和孵育的载货量均低于2 fmol（效率<0.0005%）。MALS分析还表明，电穿孔后颗粒回收率与孵育相近（约93%），而冻融和超声处理后的颗粒回收率显著降低（约18%）。电穿孔和孵育后的平均粒径均为190 nm，而超声和冻融后粒径较小。通过载货量和回收EVs数量的测量，计算出电穿孔平均每个颗粒载有56个GFP分子，远高于孵育的4个；冻融虽每个颗粒载有19个GFP，但颗粒损失严重。这些结果通过珠基流式细胞术得到证实，电穿孔和冻融显示较高的平均GFP荧光，且存在高荧光信号珠子，表明成功载货。总体而言，电穿孔是外源性载货中最有效的方法，但总体封装效率仍较低。

2.2 dSTORM-DBSCAN对单颗粒EVs的多参数表征

为表征载货分布在EV群体中的异质性，研究采用直接随机光学重建显微镜（dSTORM）这一单分子超分辨成像技术，突破光学衍射极限，实现10–20 nm分辨率，并通过基于密度的聚类算法（DBSCAN）自动检测囊泡，避免图像重建的偏差和伪影。方法验证显示，dSTORM测定的脂质体尺寸分布与纳米颗粒跟踪分析（NTA）高度一致。应用dSTORM对EVs表面标志物CD81和CD63进行共定位，显示80%的检测囊泡CD81阳性，50%CD63阳性，30%双阳性；CD81+和CD63+亚群尺寸分布重叠，而双阳性亚群稍大。CD63和CD81定位信号的距离分布表明，相同类型标记距离多小于10 nm，而不同类型标记距离多大于10 nm，提示CD81和CD63在EVs表面呈斑块状分布。不同亚群的Polsby-Popper（PP）紧凑度平均值约为0.8，形态相似。

2.3 dSTORM在单囊泡水平表征外源性载货

通过dSTORM分析GFP与EVs在单颗粒水平的共定位，EVs用抗CD63抗体标记，游离GFP和弱结合GFP通过尺寸排阻色谱去除。代表性图像显示，加载后GFP（蓝色）和CD63（红色）信号仅部分共定位。与整体技术一致，dSTORM-DBSCAN分析显示电穿孔最有效，33%的EVs与GFP共定位，而孵育仅为5%；超声处理也显示少量共定位，但SEC-FLD-MALS和流式未检测到。CD63+亚群尺寸在加载应激下变化不显著，仅电穿孔后平均直径从100 nm增至115 nm，且出现200–300 nm囊泡。加载方法对EVs紧凑度影响微小（降低<2%），且GFP分子数与紧凑度无相关性，表明GFP货物并非以聚集体形式关联。单颗粒分析揭示所有加载方法中CD63+ EV亚群的GFP分子分布广泛，呈指数衰减模式：电穿孔后多数载货EVs（22%）含1-5个GFP，1%的EVs含超过75个GFP。相同指数衰减规律在加载均质脂质体时也观察到，表明异质性源于加载过程本身。载入单个EV的GFP分子数随EV尺寸增大而增加，200–300 nm的EVs电穿孔后最多载有94个GFP，而约100 nm的EVs很少超过20个。实验测得的GFP分子数仅相当于理论体积载量（V_Max）的2.5%或表面积载量（S_Max）的4%。不同加载方法还导致GFP与CD63定位距离分布差异：电穿孔和超声处理后GFP靠近CD63，确认成功载货；而冻融后距离多为100 nm，提示载货空间分布不同，冻融和孵育可能更多关联于表面，而超声和电穿孔更多与腔内容物结合。当前方法虽能表征单颗粒水平载货异质性，但无法区分腔内封装与表面吸附，因蛋白酶或去垢剂测定与dSTORM不兼容。

2.4 结论

研究从整体和单囊泡水平表征了模型货物蛋白GFP的外源性载货。电穿孔是最有效的加载方法，载货囊泡百分比与内源性载货相当，但总体效率低下，EVs仅关联了理论蛋白容量的约2–4%，表明外源性EV载货可能更适用于递送少量蛋白质（如酶）。超分辨显微镜显示所有加载方法中，货物蛋白在单个囊泡间的分布均呈现显著异质性，遵循指数衰减模式，即低含量囊泡居多，高含量囊泡较少，且载货效率随EV尺寸增大而增加。这种高度异质性预计将显著影响载货EVs的生物活性，类似于合成纳米颗粒的情况，未来研究应关注载货效率与异质性对工程化EVs递送效率和生物活性的功能影响。

实验部分

EVs通过HEK293-F细胞培养、条件培养基澄清、核酸酶处理、超滤浓缩和尺寸排阻色谱分离制备，具有高颗粒-蛋白比（2-3e+10 prt/μg），表明高纯度。GFP通过大肠杆菌重组表达、金属螯合色谱和尺寸排阻色谱纯化。载货实验使用10¹⁰颗粒/mL EVs和10 μM GFP，方法包括孵育（室温2 h）、电穿孔（NepaGene NEPA21，参数：200 V，5 ms/脉冲，2脉冲；20 V，50 ms/脉冲，5脉冲）、超声处理（37 kHz，35°C，3 min）和冻融循环（液氮1 min，50°C水浴5 min，3次循环）。SEC-MALS-FLD分析使用Sepharose-CL4B柱，PBS洗脱，联用MALS和FLD检测；珠基流式细胞术使用抗CD81珠子捕获EVs，抗CD81-APC conjugate标记，CytoFLEX S流式细胞仪分析。dSTORM-DBSCAN成像使用尼康Ti2 Eclipse倒置显微镜，抗CD63-AlexaFluor647标记EVs，标准STORM闪烁缓冲液，ThunderSTORM插件和DBSCAN算法（ε=50 nm，最小邻居数=5）分析定位数据，通过光物理特性量化GFP含量，仅分析CD63阳性簇为EVs，采用凸包构建和Polsby-Popper测试评估形态。脂质体通过脂质膜水化、冻融和挤压制备，NTA使用Zetaview仪器测量。